特异性活化人T2R受体的苦味配体的鉴别和用于鉴别人苦味调节剂的相关测定制造技术

本发明专利技术涉及Ｔ２Ｒ味觉受体家族中特定的人味觉受体响应特定的苦味化合物的发现。本发明专利技术还涉及特定的ｈＴ２Ｒ９等位基因和它们在用相同苦味配体的功能测定中完全不同的活性的发现。本发明专利技术进一步涉及这些Ｔ２Ｒ受体在用于鉴别配体的测定中的用途，所述配体通过特定的苦味配体和相关的化合物调节这些味觉受体的活化。这些化合物可用作添加剂和／或从食品、饮料、化妆品和药物中除去以改良（阻断）Ｔ２Ｒ相关的苦味。Ｔ２Ｒ配体还可用作治疗和调节Ｔ２Ｒ相关的胃肠和代谢功能以及治疗胃肠和代谢疾病的治疗剂，所述疾病如进食障碍、食物感受、食物吸收、肥胖、糖尿病、克罗恩病、乳糜泻等。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及活化T2R家族中涉及苦味感知的许多先前报道的人G 蛋白偶联受体(GPCR)的苦味化合物的阐明。具体地，本专利技术涉及特异 性结合并活化hT2Rl、 hT2R3、 hT2R4、 hT2R5、 hT2R7、 hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hT2R13、 hT2R14、 hT2R16、 hT2R44、 hT2R50、 hT2R51、 hT2R54、 hT2R55、 hT2R61、 hT2R64、 hT2R65、 hT2R67、 hT2R71、 hT2R75和hT2R76 的苦味配体的发现。因此，以上鉴别的人T2R可用于鉴别调节(优选阻 断)与这些和其他配体相关的苦味的化合物。更具体地，本发现表明主题人味觉受体、其片段、或变体或嵌合 体，包括其直向同源物、剪接变体、单核苷酸多态性(SNP)和遗传工程 改造的突变体，可用于鉴别调节(优选阻断)苦味配体的苦味的化合物 以及活化这些受体的结构上相关的化合物和其他化合物的测定，优选 地基于细胞的高通量测定。使用这些测定鉴别的化合物可用作食品、饮料或药品中的添加剂以改善其味道。此外，本专利技术涉及改良的食品、 饮料和药物，所述改良的食品、饮料和药物经处理和配制以减少或消除活化主题T2R的苦味化合物。本专利技术还涉及主题T2R基因和相应的多肽以及表达它们的细胞在 治疗剂筛选中的用途，例如用于鉴别化合物，所述化合物可用于调节 胃肠功能例如食物感受(food sensing)、吸收、胃肠激素和肽的分泌、 运输和吸收的调控、对舌和胃肠系统中毒素的响应、胃肠和代谢病症 (例如进食障碍(eating disorders)、糖尿病、肥胖等)的治疗。相关领域描述人类可识别的基本味觉形式之一是苦味。直到最近，对苦味的生 理学仍然知之甚少。最近的研究已经开始阐明味觉生物学(Lindemann，Nature (2001))。目前已知许多苦味化合物通过与细胞表面受体相互 作用产生苦味。这些受体属于与胞内G蛋白相互作用的七跨膜结构域 受体家族。已经在人和啮齿动物中鉴别了称为T2R的GPCR的新家族 (Adler等人，Cell 100 (6): 693-702 (2000); Chandrashekar等人， Cell 100 (6): 703-711 (2000); Matsu誦i H， Montmayeur J P， Buck L B. Nature 404 (6778): 601-4 (2000))。本专利技术前的几项证据表明 T2R介导对苦味化合物的响应。第一，T2R基因在舌和腭上皮细胞的味 觉受体细胞的亚群中特异性表达。第二，人T2R之一的基因(hHRl) 位于与人对苦味化合物6-正丙基-2-硫尿嘧啶的敏感性有关的染色体 位点(Adler等人，Id.) (2000))。第三，小鼠T2R之一 (mT2R5)位于 与小鼠对苦味化合物环己酰亚胺的敏感性有关的染色体位点。还表明 raT2R5可以活化味转导素，味转导素是特异性表达于味觉细胞并与苦 味刺激转导有关的G蛋白(Wong等人，Nature 381:796-800 (1996))。 mT2R5对味转导素的活化仅出现于对环己酰亚胺的响应 (Chandrashekar等人，(Id.) (2000)。因此，已提议mT2R家族介导 小鼠的苦味响应，而hT2R家族介导人的苦味响应。仅一种人T2R表明 具有经鉴别的苦味配体——hT2R4，显示^皮地那铵活化(Chandrashekar 等人，Id.) 2000)。然而，该研究使用的有效地那铵的浓度(l. 5 mM)13非同寻常地高，即比报道的人对地那铵的苦味阀值高1()5倍(Saroli， Naturwissenschaften 71: 428-429 (1984))。因此，没有特定的苦味 配体有说服力地匹配于任何hT2R。还已表明每种hT2R能够结合多种 苦味配体。这一假设是基于hT2R家族仅由24个鉴别的成员组成，而 人类可以识别数百种不同的苦味化合物的事实。先前已经报道了 hT2R 的序列并且公开于Zuker等人(W0 01/18050 A2, (2001))和Adler 等人(W0 01/77676 Al (2001))的公布的PCT申请，两者以其全部内 容通过引用并入本文。研究T2R功能的困难之一是这些受体不易于在培养的哺乳动物细 胞系中表达。为了提高T2R的表达，将来自良好表达的GPCR(视紫红 质)的N末端序列连接到T2R序列(Chandrashekar等人，(Id.) 2000)。 由于有可用的抗体，这一 N末端标签还允许容易地监测蛋白质的表达。 此外，SSTR3标签(Bufe等人，Nat. Genet. 32:397-400 (2002))， 一种不同的N末端标签已经用于提高T2R的表达。尽管视紫红质标签 的掺入提高了一些T2R在哺乳动物细胞系中的表达，但是它们中的许 多仍然没有被十分充分地表达以用于功能研究。在一个不同的方法中， mT2R5在昆虫Sf9细胞中成功地表达并且用于使用生物化学GTP y S结 合测定的功能研究(Chandrashekar等人，(Id.) 2000)。在申请人以前的专利申请现在已获得专利权的美国序列号 09/825,882中，申请人鉴别并提供了许多当时新的人味觉受体包括 hT2R51、 hT2R54、 hT2R55、 hT2R61、 hT2R63、 hT2R64、 hT2R65、 hT2R67、 hT2R71和hT2R75的核酸序列和多肽序列。此外在美国序列号 10/628,464中，申请人提供了另一种鉴别的新人味觉受体(在其中称 为hT2R76)的多肽和DNA序列。另外，在美国序列号10/191， 058 (其以其全部内容通过引用并入 本文)中，申请人发现了特异性活化三种不同人T2R的配体。此外，申 请人最近提交了美国序列号11/455,693，其进一步鉴别了特异性结合 其他人T2R的苦味配体并且提供了相关的测定。另外，关于本专利技术的实际应用，已报道T2R和T1R味觉受体均在胃肠系统中表达。例如，Wu等人，Proc， Natl. Acad. Sci， USA 99 (4): 2392-7 (2002)报道T2R与味转导素和转导蛋白的亚基在肠内 分泌细胞(enterendocrine cell) (STC1细胞)中表达，并且这些细 胞在胃肠道中可能响应苦味配体。另外，Chen等人，AM J. Physiol. Cell Physiol. 291 (4): C726-39 (2006)报道苦味刺激在肠内分泌 STC-1细胞中诱导€&++信号和缩胆嚢素((:(:10释放。另外，Rozengurt, A J Physiol Gastrointes Liver Physiol 291(2):G171-7 (2006)报 道肠中的味觉受体可能在传递消化功能和激素和/或神经途径的控制 的分子中起作用，并且它们可以在有害药物和生存响应的检测中起作 用。jt匕夕卜,Sternini Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292 (2):G457-61 (2007)报道肠中的味觉受体可参与胃肠功本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴别调节选自ｈＴ２Ｒ１、ｈＴ２Ｒ３、ｈＴ２Ｒ４、ｈＴ２Ｒ５、ｈＴ２Ｒ７、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ９、ｈＴ２Ｒ１０、ｈＴ２Ｒ１３、ｈＴ２Ｒ１４、ｈＴ２Ｒ１６、ｈＴ２Ｒ４４、ｈＴ２Ｒ４４、ｈＴ２Ｒ５０、ｈＴ２Ｒ５４、ｈＴ２Ｒ５５、ｈＴ２Ｒ６１、ｈＴ２Ｒ６４、ｈＴ２Ｒ６５、ｈＴ２Ｒ６７、ｈＴ２Ｒ７１、ｈＴ２Ｒ７５和ｈＴ２Ｒ７６的人Ｔ２Ｒ苦味受体的化合物的测定，其中所述苦味受体特异性响应选自乙酰舒泛Ｋ、对乙酰氨基酚、２－乙酰吡嗪、芦荟素、氨基－２－降莰烷－羧酸、苦杏仁苷、穿心莲内酯、熊果苷、马兜铃酸、阿托品、番木鳖碱、４－苄基哌啶、咖啡因、氯霉素、氯喹、辛可宁、环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、环己酰亚胺、环辛酮、苯甲酸地那铵、地塞米松、盐酸地尔硫卓、二异丁胺、二甲双胍、２，６－二甲基哌啶、多塞平、马来酸依那普利、腾喜龙、依诺沙星、（－）－表儿茶素、（－）－红霉素、乙基吡嗪、法莫替丁、加巴喷丁、银杏苦内酯Ａ、甲状腺肿素、愈创木酚甘油醚、盐酸拉贝洛尔、亚麻苦苷、洛美沙星、（－）－羽扇豆宁、Ｎ－甲基硫脲、１－甲基－２－喹啉酮、甲基强的松龙、硝基萘、硝基糖精、氧氟沙星、橄榄苦苷、奥美拉唑、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、肽－ＬＰＦＮＱＬ、肽－ＬＰＦＳＱＬ、肽－ＹＱＥＰＶＬＧＰＶＲＧＰＦＰＩＩＶ、肽－ＰＶＬＧＰＶＲＧＰＦＰＩＩＶ、肽－ＰＶＲＧＰＦＰＩＩＶ、肽－ＲＧＰＦＰＩＩＶ、Ｎ－乙基－Ｎ′－苯脲、２－甲基吡啶、苦味酸、二盐酸哌仑西平、苯硫脲、强的松、普鲁卡因胺、６－正丙基－２－硫尿嘧啶、苦木素、奎纳克林、奎宁、雷尼替丁、糖精、Ｄ－（－）－水杨苷、五水合硫酸司巴丁、八乙酸蔗糖酯、马钱子碱、磺胺甲噁唑、可可碱、Ｎ－硫代乙酰苯胺、对称二苯硫脲、苯甲唑啉、甲苯基脲、曲匹地尔、三甲氧苄二氨嘧啶和Ｌ－色氨酸的至少一种苦味配体或结构上相关的化合物，所述测定包括：　ｉ．就其对至少一种所述苦味化合物诱导ｈＴ２Ｒ１、ｈＴ２Ｒ４、ｈＴ２Ｒ５、ｈＴ２Ｒ７、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ９、ｈＴ２Ｒ１０、 ｈＴ２Ｒ１３、ｈＴ２Ｒ１４、ｈＴ２Ｒ１６、ｈＴ２Ｒ４４、ｈＴ２Ｒ５０、ｈＴ２Ｒ５１、ｈＴ２Ｒ５４、ｈＴ２Ｒ５５、ｈＴ２Ｒ６１、ｈＴ２Ｒ６４、ｈＴ２Ｒ６５、ｈＴ２Ｒ６７、ｈＴ２Ｒ７１、ｈＴ２Ｒ７５和ｈＴ２Ｒ７６多肽中的至少一种的活化的效应筛选化合物，其中所述ｈＴ２Ｒ多肽分别地（１）具有包含在ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、６、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２４、２...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓东，H徐，Q李，汤辉仙，A普罗尼，
申请(专利权)人：塞诺米克斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]