一种通过结晶过程制备５’－肌苷酸二钠的方法技术

本发明专利技术涉及一种从以微生物发酵产生的５’－肌苷酸（ＩＭＰ）发酵液中制备５’－肌苷酸二钠（ＩＭＰ２Ｎａ）的方法。与离子交换树脂法相比，本发明专利技术具有减少废水的效果，并且仅通过控制温度和使用少量的有机溶剂就可产生高纯度的５’－肌苷酸二钠。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种通过结晶过程制备5’ -肌苷酸二钠(IMP2Na)的方法，更详细地 说，涉及一种在从肌苷酸(IMP)生产菌株发酵液中纯化5’-肌苷酸二钠过程中，通过结晶过 程代替已有的离子交换树脂方法，以制备5’ -肌苷酸二钠的方法。S卩，本专利技术涉及一种在保持相同的5’_肌苷酸二钠晶体产量的情况下，增加5’_肌 苷酸二钠晶体纯度的方法，同时，通过改进现有技术所用有机溶剂的结晶过程，按照性能特 有的温度、产生晶体的时间点和生长点，来控制溶解度，大幅度减少了有机溶剂的消耗量。
技术介绍
嘌呤衍生核苷酸，如5’-肌苷酸二钠(IMP2Na)，用作代谢紊乱的预防和治疗药物、 生长促进剂和抗癌药物的原材料，也用作食品添加剂，如食品工业中调味品的重要材料。5’ -肌苷酸二钠，一种调味品的成份，是从天然存在于肉和鱼等中的肌苷酸(IMP) 中，通过多种方法(如鱼和肉提取法、RNA酶降解法、微生物发酵法、发酵和合成联合法、或 RNA化学降解和合成联合法)制备的。在一种作为制备5’ _肌苷酸二钠的原材料的肌苷酸的制备方法中，我们进行了通 过微生物发酵法制备5’ _肌苷酸二钠的大量研究，并已被授予多项专利。但是，由于上述方法的产品含有以下种类的物质有色物质、糖、氨基酸、有机酸、 无机盐等，因此，必须对其进行纯化并去除其中的杂质，以获得具有能用于食品添加剂的质 量的5’ -肌苷酸二钠。之前，通过离子交换树脂纯化5’ _肌苷酸二钠的方法为，通过多个阶段，使用阳离 子交换树脂和阴离子交换树脂分离有机物质和无机物质，以得到高纯度的肌苷酸溶液；然 后浓缩并结晶肌苷酸溶液，以得到5’-肌苷酸二钠晶体(日本专利申请公开号40-39715)。 但是，使用离子交换树脂的纯化方法存在产生大量废水的缺陷。克服了上述废水相关缺陷的另一项在前方法中，公开了用真菌菌体分离微生物发 酵液，而不用离子交换树脂，然后浓缩上清液，继而使用亲水性有机溶剂进行多次结晶的方 法，得到高纯度的5’ -肌苷酸二钠。作为对使用上述方法的专利技术的考虑，公开了纯化5’ -肌苷酸二钠和5’ _鸟苷 酸钠混合物的方法(韩国专利申请公开号1987-0007197)、制备5’ -肌苷酸二钠和5’ -鸟 苷酸钠混合晶体的方法(韩国专利申请公开号1988-0010694)、形成5’ -鸟苷酸钠晶体的 方法(韩国专利申请公开号1993-0009984)和制备5，-鸟苷酸钠和5，-肌苷酸二钠混合 晶体的方法(韩国专利申请公开号2004-0018435)。但是，问题在于当微生物发酵液用真菌菌体分离并浓缩，然后使用亲水性有机溶 剂从浓缩液中得到5’ -肌苷酸二钠时，亲水性有机溶剂的用量大，而且由于亲水性有机溶 剂的加入，杂质也同时被萃取出来了。还有，因为杂质的同时萃取而减少的肌苷酸的含量会 影响随后的结晶过程，所以有必要对加入到由真菌菌体分离的发酵液中的有机溶剂的量进 行优化。因此，我们通过关注使用亲水性有机溶剂的结晶过程，研究了从微生物发酵液中 纯化肌苷酸的方法。特别是，为了解决上述问题，我们重复进行了实验来提高晶体的产量和 纯度，并最小化有机溶剂的量，因此，我们实现了工业上可用的专利技术，与现有技术相比，提高 了 5’ -肌苷酸二钠的纯度，并且在减少有机溶剂的用量的情况下能够保持其产量不变。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供生产5’ _肌苷酸二钠的方法，该方法使用能够改善现有技术 中存在的问题的微生物发酵方法，其中，大幅度减少了有机溶剂的量并且提高了晶体的纯度。通过结晶过程来实现本专利技术的目的，通过使用基于温度和加入的有机溶剂的溶解 度来建立优化的条件，然后决定了得到的5’肌苷酸二钠的纯度。本专利技术提供的制备5’_肌苷酸二钠的方法，包括第一步，从肌苷酸生产菌株的发 酵液中分离并去除真菌菌体；第二步，浓缩所述发酵液；第三步，将浓缩的发酵液的PH值调 节到6-10;第四步，加热调节pH后的发酵液体，以使预结晶的5’-肌苷酸二钠完全溶解；第 五步，冷却含有溶解的5’ -肌苷酸二钠晶体的发酵液；第六步，向冷却后的发酵液中加入亲 水性有机溶剂，以使5’ -肌苷酸二钠结晶。本专利技术中所用的微生物发酵液，是通过接种肌苷酸生产菌株培养的，培养用的菌 株可以使用能够生产肌苷酸的任何菌株，优选为棒状杆菌(Corynebacterium sp)。棒状杆 菌优选培养用于生产在发酵液中约5% -10%的肌苷酸。本专利技术的第一步可以通过选自由过滤、离心和热处理组成的组中的任意一种方法 来进行，优选用膜过滤方法来进行。本领域技术人员可以容易控制分离真菌菌体的膜过滤 方法的条件。例如，发酵液可以预热到约40-50°C，而且1. 2-1. 5atm的膜间(TMP)压力可用 于该方法。优选地，第二步的浓缩使发酵液中肌苷酸浓度为200_300g/L，最优选地，为 230-260g/L。优选地，第三步的调节使发酵液的pH值为7. 5-9. 5。优选地，第四步的加热使发酵液的温度为55-75°C。第五步的冷却是在以下条件进行的以均勻的速率冷却，以诱导加热后晶体的 自然析出，在此，优选在3-6小时内使温度冷却到10-30°C。基于此，优选的冷却速率为 5-10°C / 小时。优选地，第六步是通过以下方式进行的在浓缩的发酵液为20°C时，加入亲水性 有机溶剂。以发酵液总量的30-60 (ν/ν) %的量，加入亲水性有机溶剂。此外，所述亲水性有机溶剂可以为低级醇，优选甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或它们的 混合物中的一种或多种，最优选为甲醇，甲醇中得到的晶体形状最适于固-液分离。亲水性有机溶剂可以通过用水稀释来使用，但是当稀释率增加时，有机溶剂的加 入量也增加，工业上优选70-95 (ν/ν) %的溶剂浓度。本专利技术涉及通过结晶过程来制备5’ _肌苷酸二钠的方法，与离子交换树脂法相 比，该方法减少了废水的产生量，并且仅通过控制温度并使用少量的有机溶剂就可产生高 纯的5’ -肌苷酸二钠，从而使本专利技术在食品工业中表现出色。4附图说明图1为显示了浓缩发酵液中基于甲醇加入量％的肌苷酸的溶解度的曲线图。图2为显示了基于加入的有机溶剂甲醇的晶体的过饱和曲线的曲线图。具体实施方式在下文中，参照实施例对本专利技术的实施方式及其构建方法进行更加详细的说明， 但是，本专利技术的范围并不限于这些实施例。实施例1:5’-肌苷酸二钠结晶条件的建立为了建立优化的5’ -肌苷酸二钠的结晶条件，5’ -肌苷酸二钠的溶解度通过温度 和有机溶剂决定。5’ -肌苷酸二钠的溶解度用HPLC测定，在温度为20°C、30°C、40°C、50°C 和60°C时，将总溶液中有机溶剂的浓度(％ ν/ν)调节至为0-60% (图1)。过饱和曲线通过以下方法获得使用在线颗粒尺寸分析仪，测定5’肌苷酸二钠溶 液在实际发酵液中的溶解度；记录基于温度的、在每个有机溶剂浓度(％ ν/ν)下的核形成 突然增加的点，以及当温度增加时核形成突然消失的点；每分钟对颗粒的个数和颗粒的平 均尺寸及浓度等进行分析。通过实验，通过温度和加入的有机溶剂，得到了 5’-肌苷酸二钠 在发酵浓缩液中的溶解度；通过冷却温度计算结晶率，以寻找合适的冷却温度；并与从早 期阶段通过加入亲水性有机溶剂得到的冷却温度进行比较。结果如图1和2所示。结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备５’－肌苷酸二钠的方法，其中，该方法包括：第一步，从肌苷酸生产菌株的发酵液中分离并去除真菌菌体；第二步，浓缩所述发酵液；第三步，将浓缩的发酵液的ｐＨ值调节到６－１０；第四步，加热调节ｐＨ后的发酵液，以使预结晶的５’－肌苷酸二钠完全溶解；第五步，冷却含有溶解的５’－肌苷酸二钠晶体的发酵液；以及第六步，向冷却后的发酵液中加入亲水性有机溶剂，以使５’－肌苷酸二钠结晶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】KR 2007-12-28 10-2007-0140740一种制备5’ 肌苷酸二钠的方法，其中，该方法包括第一步，从肌苷酸生产菌株的发酵液中分离并去除真菌菌体；第二步，浓缩所述发酵液；第三步，将浓缩的发酵液的pH值调节到6 10；第四步，加热调节pH后的发酵液，以使预结晶的5’ 肌苷酸二钠完全溶解；第五步，冷却含有溶解的5’ 肌苷酸二钠晶体的发酵液；以及第六步，向冷却后的发酵液中加入亲水性有机溶剂，以使5’ 肌苷酸二钠结晶。2.根据权利要求1所述的制备5’-肌苷酸二钠的方法，其中，所述第二步的浓缩在肌 苷酸的浓度为200-300g/L时停止。3.根据权利要求1所述的制备5’-肌苷酸二钠的方法，其中，所述第四步的加热是在 55-75 °C下进行的。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：金日出，洪淳源，尹太相，俞裁宪，李允宰，朴南燮，李种勋，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]