定量测定小而密ＬＤＬ胆固醇的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种分级测定小而密ＬＤＬ的方法以及试剂，其使得能够在无需任何预处理样品的情况下进行快速、简便和高特异性的分析。本发明专利技术具体公开了用于定量测定样品中小而密ＬＤＬ胆固醇的方法，所述方法包括以下步骤（１）和（２）：（１）在磷脂酶存在下清除除小而密ＬＤＬ之外的ＬＤＬ中的胆固醇，和（２）测定经过步骤（１）后剩余的脂蛋白中的胆固醇的量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及测定小而密LDL中胆固醇的方法和试剂，这对于动脉硬化的诊断是重要的。
技术介绍
胆固醇是细胞的一种重要组分，也是临床上重要的组分，因为过高水平的胆固醇导致在内皮下间隙中的巨噬细胞摄取胆固醇后使巨噬细胞转化为泡沫细胞(foam cell)并继而导致动脉硬化的原发病灶的发展。低密度脂蛋白(LDL)在血液的胆固醇运输中起主要作用并且是动脉硬化的危险因素。已知小而密LDL，其在LDL中粒度特别小并且与标准LDL相比密度更高，具有多于正常LDL数倍水平的致动脉粥样化的能力。小而密LDL的增加是动脉硬化的主要危险因素之一。因此在临床上进行此类小而密LDL的分级测定(fractional measurement)是非常重要的用于测定小而密LDL的常规方法的实例包括超速离心法、电泳法以及使用高效液相色谱的方法。由于这些方法需要昂贵的设备和大量测量时间，因此并不方便。一种利用自动分析仪测量小而密LDL的方法的实例是以下方法(参见日本专利公布(Kokai)第2003-28882A号)，该方法涉及利用离子强度差异将小颗粒LDL悬浮或溶解，然后利用吸光度差异对小颗粒LDL进行测定。然而，吸光度差异依照上述方法是基于浊度测定的。因此不能测定小而密LDL中胆固醇，因而特异性和准确度不足。此外，已知一种方法(参见国际专利公布WO2004/053500)，该方法涉及通过使用包含聚阴离子和二价阳离子的分离剂与适合于自动分析仪的试剂的组合来测量小而密LDL中的胆固醇或三酰甘油。该方法能够比超速离心法或电泳法更方便地测量小而密LDL中的脂质组分。此外，该方法的特异性和准确度极好。但是该方法需要预处理试样并需要将LDL分离成小而密LDL和除这种LDL之外的LDL的步骤。本专利技术的公开内容本专利技术要实现的目标本专利技术的一个目标是提供一种适用于自动分析仪的分级测定小而密LDL的方法以及用于此类测定的试剂，所述方法和试剂能够在无需预处理试样下进行具有良好特异性的、快速且方便的分析。实现该目标的手段作为集中研究的结果，本专利技术人完成了一种用于测量小而密LDL的新方法。具体而言，当利用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶测量含各种脂蛋白的样品中的胆固醇时，酶对除小而密LDL之外的LDL的反应速率增加的程度大于酶对小而密LDL的反应速率增加的程度，这是由于利用了磷脂酶特异性地与特定底物反应。因此，通过利用过氧化氢酶和4-氨基安替比林可清除除小而密LDL之外的LDL中的胆固醇并将其排除在反应体系之外。其后，使用用于胆固醇测定的酶进行酶反应，以便可对LDL中、特别是小而密LDL中的胆固醇进行测定。此外，当在将除小而密LDL之外的LDL排除在反应体系之外的反应-->前或反应后加入与除LDL之外的脂蛋白(例如HDL和VLDL)反应的特定表面活性剂时，所述特定表面活性剂与除LDL之外的脂蛋白(例如HDL和VLDL)反应，致使可通过过氧化氢酶或4-氨基安替比林清除HDL或VLDL中的胆固醇并将其排除在反应体系之外。用于清除除小而密LDL之外的LDL的此类反应和用于经由脂蛋白(例如HDL和VLDL)与特定表面活性剂的反应清除HDL或VLDL中的胆固醇的反应可同时进行，以便可将除小而密LDL之外的脂蛋白清除并将其排除在反应体系之外。由此剩余的小而密LDL与用于胆固醇测定的酶反应，致使可成功地分级并单独测定小而密LDL中的胆固醇。此外，指定表面活性剂的类型和酶的浓度以便可使以下两种反应在同一溶液中顺利进行：用于清除除小而密LDL之外的上述脂蛋白以将其排除在反应体系之外的反应和用于清除HDL和VLDL中的胆固醇以将其排除在反应体系之外的反应。因此，本专利技术得以完成。本专利技术为如下所述。[1]一种用于定量测定样品中的小而密LDL胆固醇的方法，该方法包括以下步骤：(1)在磷脂酶存在下清除除小而密LDL之外的LDL中的胆固醇，以及随后(2)定量测定小而密LDL中的胆固醇。[2]根据[1]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(1)中采用的磷脂酶与至少鞘磷脂和/或磷脂酰肌醇具有高反应性，其为存在于脂蛋白中的磷脂。[3]根据[1]或[2]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(1)中使用的磷脂酶的浓度范围为0.1U/mL-100U/mL。[4]根据[1]-[3]中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其在中步骤(2)中在至少作用于小而密LDL的表面活性剂的存在下加入用于胆固醇测定的酶。[5]根据[4]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(2)中使用的至少作用于小而密LDL的表面活性剂是作用于所有脂蛋白的表面活性剂。[6]根据[4]或[5]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(2)中使用的至少作用于小而密LDL的表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或其衍生物、或HLB为11以上且小于14的聚氧乙烯衍生物。[7]根据[1]-[6]中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，所述方法还包括在胆固醇酯酶存在下清除样品中除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的步骤(a)，该步骤在步骤(2)之前并在步骤(1)之前、之后或同时实施。[8]根据[7]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(a)中使用的胆固醇酯酶的浓度范围为0.01U/mL-10U/mL。[9]根据[7]或[8]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(a)中还加入作用于除LDL之外的脂蛋白的表面活性剂。[10]根据[9]的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(a)中使用的表面活性剂的浓度范围为0.05％-1.0％。[11]根据[7]-[10]中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(a)中还加入胆固醇氧化酶和过氧化氢酶。[12]根据[7]-[10]中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(a)中还加入4-氨基安替比林。[13]根据[7]-[12]中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤-->(a)的反应和步骤(1)的反应在同一溶液中同时进行。[14]根据[7]-[13]中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(a)中采用的表面活性剂为：选自聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯烷基胺的非离子型表面活性剂；选自聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基硫酸盐、酰胺醚硫酸盐、烷基牛磺酸盐和磷酸盐型表面活性剂的阴离子型表面活性剂；选自烷基甲基铵盐、季铵盐和单直链烷基型表面活性剂的阳离子型表面活性剂；或者选自月桂基甜菜碱、二甲基烷基甜菜碱、咪唑啉型表面活性剂以及烷基二氨基乙基甘氨酸钠的两性表面活性剂。[15]一种用于定量测定小而密LDL胆固醇的试剂盒，所述试剂盒包含至少以下两类试剂组合物：(i)用于清除样品中除小而密LDL之外的LDL中的胆固醇的试剂组合物，该试剂组合物含有至少与除小而密LDL之外的LDL反应的磷脂酶；(ii)用于测定小而密LDL的试剂组合物，其包含：仅与小而密LDL或其衍生物反应的作为聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的表面活性剂；或作为HLB在11以上且小于14的聚氧乙烯衍生物的表面活性剂；4-氨基安替比林；和过氧化物酶。[16]根据[15]的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量测定样品中的小而密ＬＤＬ胆固醇的方法，所述方法包括以下步骤：（１）在磷脂酶存在下清除除小而密ＬＤＬ之外的ＬＤＬ中的胆固醇，以及随后（２）定量测定剩余的小而密ＬＤＬ中的胆固醇。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2007-10-10 2007-2649081.一种定量测定样品中的小而密LDL胆固醇的方法，所述方法包括以下步骤：(1)在磷脂酶存在下清除除小而密LDL之外的LDL中的胆固醇，以及随后(2)定量测定剩余的小而密LDL中的胆固醇。2.权利要求1的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(1)中使用的磷脂酶与至少鞘磷脂和/或磷脂酰肌醇具有高反应性，其为存在于脂蛋白中的磷脂。3.权利要求1或2的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(1)中使用的磷脂酶的浓度范围为0.1U/mL-100U/mL。4.权利要求1-3中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(2)中在至少作用于小而密LDL的表面活性剂的存在下加入用于胆固醇测定的酶。5.权利要求4的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(2)中使用的至少作用于小而密LDL的表面活性剂是作用于所有脂蛋白的表面活性剂。6.权利要求4或5的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(2)中使用的至少作用于小而密LDL的表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或其衍生物、或HLB为11以上且少于14的聚氧乙烯衍生物。7.权利要求1-6中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，所述方法还包括在胆固醇酯酶存在下清除样品中的除LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的步骤(a)，该步骤在步骤(2)之前并在步骤(1)之前、之后或者同时实施。8.权利要求7的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(a)中使用的胆固醇酯酶的浓度范围为0.01U/mL-10U/mL。9.权利要求7或8的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(a)中还加入作用于除LDL之外脂蛋白的表面活性剂。10.权利要求9的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(a)中使用的表面活性剂的浓度范围为0.05％-1.0％。11.权利要求7-10中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(a)中还加入胆固醇氧化酶和过氧化氢酶。12.权利要求7-10中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中在步骤(a)中还加入胆固醇氧化酶和4-氨基安替比林。13.权利要求7-12中任一项的用于定量测定小而密LDL胆固醇的方法，其中步骤(a)的反应和步骤(1)的反应在同一溶液中同时进行。14.权利要求7-13中任一项的用于定量测定小...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊藤康树，藤村美树，
申请(专利权)人：电化生研株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]