重组HCV E2糖蛋白制造技术

本发明专利技术提供了经修饰的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２糖蛋白，其包含包括ＨＶＲ１、ＨＶＲ２和ｉｇＶＲ可变区的ＨＣＶ－Ｅ２受体结合结构域（ＲＢＤ），其中在所述可变区的至少一个中，可变区的至少一部分被柔韧的连接体序列替代。本发明专利技术还提供了包含所述经修饰的糖蛋白的疫苗组合物以及其使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于丙型病毒性肝炎(HCV )感染的新型和改进的治疗。 特别地，本专利技术涉及疫苗组合物，其用于基于施用重组HCV多蛋白来预 防性和治疗性地治疗HCV感染。
技术介绍
根据世界卫生组织的报告，丙型肝炎病毒(HCV )在世界范围内感 染大约1.7亿至2亿人。尽管政府已增加了关于HCV如何传播的教育，以 及尽管采取了预防计划，但是HCV仍继续扩散。大约80。/。的感染了HCV 的人仍然是该病毒的携带者。在澳大利亚，每年报导大约16， OOO例新 的HCV感染病例，新感染在静脉注射吸毒者(injection drug user) 中最为盛行。HCV是最常见的血液传播的病毒感染，其导致相当大比例 的人口死亡。已知HCV感染受害者的肝脏和某些免疫细胞。因此，HCV比其他形 式的肝炎更频繁地导致严重的肝病，例如纤维化、肝硬变、脂肪变性 和肝细胞癌(肝癌)。HCV是导致需要肝移植的首要原因。通常认为， 感染的急性期常常由于该感染的亚临床性质而未被识别，并且80%的个 体发展成慢性状态。慢性感染是免疫系统不能产生针对该病毒的足够 免疫应答的结果。目前，没有用于HCV的疫苗，并且唯一可获得的用于治疗HCV的疗 法依赖于抗病毒药物和药物组合的开发。抗病毒药物设计背后的一般 理念是鉴定可以被使得丧失功能或被抑制的病毒蛋白质或蛋白质的部 分。选择用于患有中度或严重纤维化的患者的标准治疗包括a -干扰素或利巴韦林的组合。a-干扰素和利巴韦林联合疗法的抗病毒效果导致 血液中HCV水平的快速降低，甚至在单次剂量后。然而，用于HCV的常 规a-干扰素治疗具有几个缺点。例如，(i)当在数周或数月的治疗后 停止a-干扰素治疗时，已知病毒载量水平快速地重新建立；(ii)使 用a-干扰素/利巴韦林的治疗伴随着严重的副作用，包括流感样症状， 减少的红细胞或白细胞计数，骨髓抑制，神经精神效应，特别是抑郁 症和贫血；(Hi)有效的治疗需要患者坚持接受频繁的给药方案，因 为a-干扰素快速地被吸收和被从身体中去除；以及(v)此类治疗的高 费用。上述缺点中的一些(特别地提及上述的第(iii)项)已通过使a-干扰素经历其中将聚乙二醇分子附着至干扰素的'PEG化，而得到了解 决。PEG化的干扰素与利巴韦林的联合施用增加了干扰素的半衰期，并 且具有减少给药频率从而增加患者顺应性的优点。然而，已证明这样 的治疗在少于50。/。的接受治疗的患者中是有效的。基于慢性HCV受害者 的数目不断增加的情况，存在对于开发用于预防性和治疗性目的的疫 苗的需要。开发提供针对HCV感染的保护的成功疫苗一直以来是很困难的。该 困难的一个所提及的原因是，作为RNA病毒的HCV在遗传上是不稳定的， 这使得其能够达到高的病毒突变率，从而逃避身体的免疫应答。因此， 鉴定病毒的保守的部分是对研究者的挑战。HCV被分类在黄病毒科(FUvividae)的分开的属(丙型肝炎病 毒属(Hepacivirus))中。HCV是非致细胞病变的，而是触发免疫应 答，该免疫应答快速清除感染或起始炎症反应，从而导致慢性感染和 肝损伤。在~ 30。/。的急性病例中发生永久性地清除HCV RNA而无需治疗 的自发解除感染，这暗示了对HCV的天然免疫性，从而对于疫苗开发的 前景而言是令人鼓舞的。然而，HCV感染的该结果的决定因素是未知的。HCV病毒粒子包含大约9. 5 kb的正义单链RNA基因组。该基因组编 码具有3， 010至3， 030个氨基酸的单个多蛋白。结构蛋白包括形成病毒 核壳体的核心蛋白和两个包膜糖蛋白E1和E2。一些最近的向着HCV疫苗开发的努力集中在HCV包膜糖蛋白E1和E2上。已发现，E1和E2在病毒粒 子的表面上形成非共价结合的异二聚体，其介导病毒的附着和进入， 并从而提供了用于宿主免疫应答的靼标。最近的研究表明，包膜糖蛋白E2与CD4+T细胞表面上的CD81结合。 在该结合过程中，E2经历快速的构象变化。迄今为止，还没有研究能 够提供合适的经修饰的包膜糖蛋白，其可以展现出野生型，，水平的 CD81结合。在整个本说明书(包括权利要求)中，HCV包膜糖蛋白E1和E2的多 肽残基的所有编号均基于原型HCV-H77多蛋白序列，Genbank登录号AF 009606。糖蛋白E1的成熟形式被包括于多蛋白残基191和383之间，糖 蛋白E2的成熟形式被包括于多蛋白残基384和746之间。E2的受体结合结构域(RBD)被包括于多蛋白残基384和661之间 (E 2661 )。重组形式的E2^ RBD有效地从经转染的细胞中分泌，并且 能够与CD81和其他细胞表面分子相互作用。E2 RBD包含两个可变区， 證l ( 384-410)和證2 ( 474-482 )。位于E2的N-末端的可变区1是HCV基因组中最可变的区域，其具有 高度的免疫原性并且快速地积累中和逃避突变(neutralization escape mutation)。尽管HVR1中存在高水平的氨基酸变异性，但存在 对于病毒进入而言重要的碱性残基的总体保守性。可变区2位于側翼为Cys-459和Cys-486的区域内。尽管最初被描述 为7-残基序列，但是来自不同HCV基因型的E2序列的比较表明其可从残 基461延伸至481。与HVR1相比，HVR2的序列在被HCV感染的人中是相对 稳定的，虽然在该位置处的突变的积累已显示与对干扰素-a治疗的应 答性相关。在导致本专利技术的工作中，本专利技术人观察到，代表了HCV的6种主要 基因型的E2序列的比对揭示出了之前未描述过的在多蛋白残基570和 580之间可变区，其在基因型之内相对保守，但由于氨基酸的插入和缺 失而在各基因型之间发生变化。因此，氨基酸570-580被称为基因型间 可变区(intergenotypic variable region, igVR)。 来自HCV的所7有6种基因型以及其中的趋异分离林(divergent isolate)的相应区 域的检查显示，igVR的側翼也为保守的半胱氨酸残基(Cys-569和 Cys-581 )， 这表明这些序列形成受二疏化物约束的环 (disulfide-constrained loops)。迄今为止，使用适应性免疫应答途径进行的HCV的疫苗治疗还未曾 获得成功。由于用于治疗HCV的目前的实验性疗法的缺点，因而存在对 于提供细胞介导的免疫应答以治疗HCV感染的未满足的需要。本专利技术的一个目的是提供用于预防或治疗HCV感染的免疫治疗方 法。本专利技术的另一个目的是提供用于预防或治疗HCV感染的免疫治疗方 法。本专利技术的另一个目的是提供经修饰的E2糖蛋白，所述糖蛋白接近 对于HCV感染的天然细胞受体的野生型结合水平。国际专利/^开号W0 02/22155 (Hawaii Biotechnology Group, Inc.)公开了截短的HCV E2多肽，其缺少HVR1区域并且当在宿主细胞 中以重组形式表达时能够分泌入生长培养基中。该多蛋白也可以缺少 在残基662之后的其C-末端。国际专利公开号W0 03/022880 ( XTL Biopharmaceuticals Ltd.)也公开了缺少HVR1区域的E2蛋白的截短 形式。上述论述意在介绍本专利技术的领本文档来自技高网...

【技术保护点】
经修饰的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２糖蛋白，其包含包括ＨＶＲ１、ＨＶＲ２和ｉｇＶＲ可变区的ＨＣＶ－Ｅ２受体结合结构域（ＲＢＤ），其中在所述可变区的至少一个中，可变区的至少一部分被柔韧的连接体序列替代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】AU 2006-8-25 2006904635;AU 2006-11-1 2006906090;AU1.经修饰的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可变区的HCV-E2受体结合结构域(RBD)，其中在所述可变区的至少一个中，可变区的至少一部分被柔韧的连接体序列替代。2. 权利要求1的经修饰的糖蛋白，其中在所述可变区的两个中， 可变区的至少一部分被柔韧的连接体序列替代。3. 权利要求2的经修饰的糖蛋白，其中所述两个可变区是HVR1和 HVR2可变区。4. 权利要求2的经修饰的糖蛋白，其中所述两个可变区是HVR1和 igVR可变区。5. 权利要求2的经修饰的糖蛋白，其中所述两个可变区是HVR2和 igVR可变区。6. 权利要求1的经修饰的糖蛋白，其中在所有三个所述可变区中， 可变区的至少 一部分被柔韧的连接体序列替代。7. 权利要求1的经修饰的糖蛋白，其中在HVR2和igVR可变区的 至少一个中，可变区的至少一部分被柔韧的连接体序列替代。8. 权利要求7的经修饰的糖蛋白，其中在HVR2和igVR可变区两 者中，可变区的至少一部分被柔韧的连接体序列替代。9. 权利要求7的经修饰的糖蛋白，其中在HVR2可变区中，可变区 的至少 一部分被柔韧的连接体序列替代。10. 权利要求7的经修饰的糖蛋白，其中在igVR可变区中，可变 区的至少 一部分被柔韧的连接体序列替代。11. 权利要求7至10中任一项的经修饰的糖蛋白，其中HVR1可变 区的至少 一部分被去除或被柔韧的连接体序列替代。12. 经修饰的丙型肝炎病毒(HCV) E2糖蛋白，其包含包括HVR1、 HVR2和igVR可变区的HCV-E2受体结合结构域(RBD )，其中HVR2可 变区的至少 一部分被去除或被柔韧的连接体序列替代。13. 权利要求12的经修饰的糖蛋白，其中在HVR1和igVR可变区的至少一个中，可变区的至少一部分被柔韧的连接体序列替代。14. 经修饰的丙型肝炎病毒(HCV) E2糖蛋白，其包含包括HVR1、 HVR2和igVR可变区的HCV-E2受体结合结构域(RBD )，其中igVR可 变区的至少 一部分被去除或被柔韧的连接体序列替代。15. 权利要求14的经修饰的糖蛋白，其中在HVR1和HVR2可变区 的至少一个中，可变区的至少一部分被柔韧的连接体序列替代。16. 权利要求1至15中任一项的经修饰的糖蛋白，其中该连接体 序列或每个连接体序列允许所述糖蛋白与HCV受体CD81结合。17. 权利要求16的经修饰的糖蛋白，其中该连接体序列或每个连 接体序列包含具有至多20个氨基酸残基的肽序列，并且包含选自Gly、 Ser、 Ala、 T...

【专利技术属性】
技术研发人员：K麦克卡弗雷，H卓莫，P鲍伯里奥斯，
申请(专利权)人：麦克法兰布奈特医疗研究与公共健康研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]