锌指核酸酶介导的同源重组制造技术

本发明专利技术公开了用于将外源序列靶向整合入植物基因组中预定靶位点的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】锌指核酸酶介导的同源重组 专利
本公开在植物中基因组工程、基因靶向、靶向染色体整合及蛋白质表达 领域中。
技术介绍
农业中感兴趣的一个主要领域(尤其是根据大量植物基因组的全核苦酸 序列的测定)是基因组序列的靶向改变。具体地，转换内源植物序列的能力 会促进众多应用，诸如例如优化影响营养价值、产量、应力耐性、病原体抗化合物或工业化学品。在真核生物中，已经试图通过利用同源重组的自然现象来改变培养细胞中的基因组序列。参见例如Capecchi (1989) Sc/ece 244:1288-1292;美国专 利No. 6，528，313及6,528,314。如果多核苷酸与含有待改变序列的基因组区域 具有足够的同源性，那么该多核苷酸的部分或整个序列通过同源重组来替换 该基因组序列是可能的。然而，这些情况下的同源重组频率是极低的。此外， 缺乏序列同源性的基因组位置处的外源多核苷酸插入频率超过同源重组频 率达几个数量级。在基因组中与外源多核苷酸具有同源性的区域中将双链断裂导入基因 组DNA中已有显示刺激培养细胞中该位点处的同源重组达数千倍。Rouet等 (1994) Mo/. CW/. 5/。/. 14:8096-8106; Choulika等(1995) Mo/. Ce〃.所o/. 15:1968-1973; Donoho等(1998) Mo/. Ce〃. Ao/. 18:4070-4078。还可参见 Johnson等(2001) A.oc/7e附.5bc. rra肌29:196-201;及Yanez等(1998) 77^rap少5:149-159。在这些方法中，期望基因组区域中对DNA的切割是通过 将大范围核酸酶(即一种内切核酸酶，该内切核酸酶的识别序列如此之大以 致它在感兴趣的基因组中不存在或仅罕见存在)的识别位点插入所述期望基 因组区域中而实现的。然而，大范围核酸酶切割作用刺激的同源重组依赖于待改变基因组区域附近合适的大范围核酸酶识别位点的偶然存在或定向插入。由于在典型的植 物基因组中大范围核酸酶识别位点是罕见的(或是不存在的)，而合适的大 范围核酸酶识别位点的插入受到与其它基因组改变有关的同样困难的困饶， 因此这些方法不可广泛应用。如此，仍然需要用于在任何植物基因组中靶向改变序列的组合物和方法 及用于将外源序列靶向导入基因组中的组合物和方法。专利技术概述本公开提供了用于在植物细胞中靶向切割感兴趣区域中的细胞染色质 和/或在感兴趣的预定区域处同源重组的组合物和方法。植物细胞可以来自单子叶(monocot)或双子叶(dicot)植物物种，而且还包括培养细胞、处于任何发 育阶段的植物中的细胞、及已经从整个植物中取出且该细胞(或其后代)会 返回所述植物的植物细胞。细胞染色质中的感兴趣区域可以是例如基因组序列或其部分。组合物包 括包含工程化(engineered)锌指结合结构域(例如具有新特异性的锌指结合结 构域)和切割结构域的融合多肽，及包含工程化锌指结合结构域和切割半结 构域(half-domain)的融合多肽。切割结构域和切割半结构域可以获自例如各 种限制性内切核酸酶和/或归巢(homing)内切核酸酶。一方面，本文所描述的是一种载体，其包含第一和第二DNA序列，其中 (i)所述第 一序列是与第三序列同源的，且所述第二序列是与第四序列同源 的；(ii)所述第三和第四序列是染色体DNA序列；且(iii)所述第三和第四序列 的近边缘(nearedge)是由至少l个核苷酸对分开的。在某些实施方案中，所述 第三和第四序列是内源序列。在任何本文所述载体中，所述第一或第二序列中至少一种的长度为100 个核苷酸。另外，任何本文所述载体还可以包含第五序列，其中所述第五序 列(a)是插入所述第一和第二序列之间的；且(b)是外源序列。在某些实施方 案中，所述第五序列的大小为至少一个碱基对，但可以大到22千碱基对。载体(例如第五序列)还可以包含编码蛋白质或蛋白质之一部分的序歹'J。 在某些实施方案中，所述蛋白质编码序列编码选择标志(例如绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP)、卩-葡糖醛酸糖香酶((3-glucuronidase, GUS)、 膦丝菌素N-乙酰转移酶(phosphinothricin N-acetyl transferase, PAT, BAR)、新霉素碌酸转移酶(neomycin phosphotransferase) 、 p-内酰胺酶((3-lactamase)、 儿 茶酚双力口氧酶(catechol dioxygenase) 、 a-淀粉酶(a-amylase)、 酪氨酸酶 (tyrosinase)、卩-半乳4唐香酶(卩画galactosidase)、萤光素酶(luciferase)、水母发光 蛋白(a叫uorin)、 EPSP合酶(EPSP synthase),腈水解酶(nitrilase)、乙酰乳酸合 酶(acetolactate synthase, ALS) 、 二氬叶酸还原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)、茅草枯脱卣素酶(dalapon dehalogenase)、及邻氨基苯曱酸合酶 (anthranilate synthase))。在其它实施方案中，所述蛋白质编码序列(例如第 五序列)编码蛋白质或蛋白质之一部分，例如与染色体序列同源的序列。在其它实施方案中，载体(例如第五序列)包含一种或多种转录调节序 列。在还有一些实施方案中，载体(例如第五序列)可以包含突变型染色体 序列的野生型对应物(counterpart),或者，野生型染色体序列的突变型对应物。在任何本文所述载体中，第 一序列与第三序列可以具有至少35%的同源 性。类似地，在任何本文所述载体中，第二序列与第四序列可以具有至少35% 的同源性。在有些实施方案中，第一序列与第三序列具有至少35%至50%、 至少50%至70%、至少70°/。至80%、至少80°/。至85%、至少85%至90%、至少 90%至95%、至少95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%的同源性。在有些实 施方案中，第二序列与第四序列具有至少35°/。至50%、至少50%至70%、至 少70%至80%、至少80%至85%、至少85°/。至90%、至少90%至95%、至少95%、 96。/。、 97%、 98%、 99%或100%的同源性。又一方面，本文所描述的是一种用于将外源序列导入植物细胞基因组中 的方法，该方法包括以下步骤(a)使所述细胞与任何上文所述载体接触；并 (b)在所述细胞中表达一种或多种核酸酶，其中所述一种或多种核酸酶切割距 所述第三或第四序列之任一种0.4-3千碱基对内的染色体DNA;使得步骤(b) 中对染色体DNA的切割刺激所述靶向载体通过同源重组而掺入所述基因组 中。在某些实施方案中，所述一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的 切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。又一方面，本文所提供的是一种用于在植物细胞中表达蛋白质的方法， 该方法包括以下步骤(a)使所述细胞与本文所述载体接触；并(b)在所述细胞 中表达一种或多种核酸酶，其中所述一种或多种核酸酶切割本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种供体载体，其包含第一和第二ＤＮＡ序列；　其中所述第一序列是与第三序列同源的，且所述第二序列是与第四序列同源的；　其中所述第三和第四序列是染色体ＤＮＡ序列；且　其中所述第三和第四序列的近边缘是由至少１个核苷酸对分开的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-8-11 60/837,1471.一种供体载体，其包含第一和第二DNA序列；其中所述第一序列是与第三序列同源的，且所述第二序列是与第四序列同源的；其中所述第三和第四序列是染色体DNA序列；且其中所述第三和第四序列的近边缘是由至少1个核苷酸对分开的。2. 权利要求l的载体，其中所述第三和第四序列是内源序列。3. 权利要求1或权利要求2的载体，其中所述第一或第二序列中至少一种的长度为100个核苷酸。4. 权利要求1至3中任一项的载体，其还包含第五序列，其中所述第五序列(a) 是插入所述第一和第二序列之间的；且(b) 是外源序列。5. 权利要求4的载体，其中所述第五序列的大小为至少一个碱基对。6. 权利要求4的载体，其中所述第五序列包含编码选择标志的序列。7. 权利要求6的载体，其中所述选择标志选自绿色荧光蛋白(GFP)、 (3-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT, BAR)、新霉素磷酸转移酶、(3-内酰胺酶、儿茶酚双加氧酶、a-淀粉酶、酪氨酸酶、(3-半乳糖苷酶、萤光素酶、水母发光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳酸合酶(ALS)、 二氢叶酸还原酶(DHFR)、茅草枯脱卣素酶、及邻氨基苯曱酸合酶。8. 权利要求4的载体，其中所述第五序列包含编码选择标志以外的蛋白质的序列。9. 权利要求4的载体，其中所述第五序列包含一种或多种转录调节序列。10. 权利要求4的载体，其中所述第五序列包含编码蛋白质之一部分的序列。11. 权利要求10的载体，其中所述编码蛋白质之一部分的序列包含与染色体序列同源的序列。12. 权利要求4的载体，其中所述第五序列包含突变型染色体序列的野生型对应物。13. 权利要求4的载体，其中所述第五序列包含野生型染色体序列的突变型对应物。14. 权利要求1至13中任一项的载体，其中所述第一序列与所述第三序列具有至少35%的同源性。15. 权利要求1至14中任一项的载体，其中所述第二序列与所述第四序列具有至少35%的同源性。16. 权利要求14的载体，其中所述第二序列与所述第四序列具有至少35%的同源性。17. —种用于将外源序列导入植物细胞基因组中的方法，该方法包括以下步骤(a) 使所述细胞与依照权利要求1至16中任一项的靶向载体接触；并(b) 在所述细胞中表达一种或多种核酸酶，其中所述一种或多种核酸酶切割距所述第三或第四序列之任一种3千碱基对内的染色体DNA;使得步骤(b)中对染色体DNA的切割刺激所述靶向载体通过同源重组而掺入所述基因组中。18. 权利要求17的方法，其中所述一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。19. 一种用于在植物细胞中表达蛋白质的方法，该方法包括以下步骤(a) 使所述细胞与依照权利要求8的靶向载体接触；并(b) 在所述细胞中表达一种或多种核酸酶，其中所述一种或多种核酸酶切割距所述第三或第四序列之任一种3千碱基对内的染色体DNA;4吏得步骤(b)中对染色体DNA的切割刺激所述靶向载体通过同源重组而掺入所述基因组中。20. 权利要求19的方法，其中所述一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。21. —种依照权利要求17、 18、 19或20中任一项的方法而获得的转基因植物细胞。22. —种植物，其包含依照权利要求21的转基因植物细胞。23. —种用于在细胞基因组中进行分子内同源重组的方法，该方法包括以下步骤(a) 提供包含第一序列的DNA区段，所述第一序列是与第二序列同源的；并(b) 使所述DNA区段与核酸酶接触，其中所述核酸酶在第三序列处切割所述DNA区段。24. 权利要求23的方法，其中所述DNA区段对于所述细胞是内源的。25. 权利要求23或权利要求24的方法，其中所述同源重组在染色体中发生。26. 权利要求25的方法，其中从所述染色体中删除所述第一和第二序列之间的DNA。27. 权利要求23、 24、 25或26中任一项的方法，其中所述第三序列在所述基因组中是唯一的。28. 权利要求23至26中任一项的方法，其中所述细胞是植物细胞。29. 权利要求23至28中任一项的方法，其中所述核酸酶是一对融合蛋白，其中每个融合蛋白是IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域和工程化锌指结合结构域之间的融合物。30. 权利要求23至29中任一项的方法，其中所述第三序列距离所述第一序列至少100个碱基对。31. 权利要求23至30中任一项的方法，其中所述第三序列距离所述第二序列至少100个^威基对。32. 权利要求23至31中任一项的方法，其中所述第三序列位于所述第一和第二序列之间。33. 权利要求23至32中任一项的方法，其中所述第一或第二序列之一对于所述生物体是外源的。34. 权利要求23至32中任一项的方法，其中所述第一和第二序列对于所述生物体都是外源的。35. 权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡其华，杰弗里米勒，威廉M安利，罗比J加里森，约瑟夫F皮托利诺，贝丝C鲁宾威尔逊，莉萨L舒伦伯格，安德鲁F沃登，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，桑格摩生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]