用于免疫刺激的链状物制造技术

本发明专利技术涉及用于调节人或动物免疫系统活性的多聚非编码性核酸分子，并涉及其生产方法，并涉及包含所述多聚非编码性核酸分子的疫苗。所述多聚非编码性核酸分子可以是由至少两个所述分子（二聚体）或几个非编码性核酸分子的装配物组成的非编码性核酸分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于调节人和动物免疫系统活性的多聚非编码性核酸分子，以及用于 制备该分子的方法，和包含这种多聚非编码性核酸分子的疫苗，其中多聚非编码性核酸分 子可理解为非编码性核酸分子，其包含所述非编码性核酸分子的至少两个连接的分子(二 聚体)。
技术介绍
当适应性免疫应答在针对相应病原体选择特定淋巴细胞并克隆性扩张和分化这 些淋巴细胞之后从一个延迟(3-5日)开始，并且然后通过形成免疫记忆而提供针对相应 病原体的长期持久保护作用，先天免疫系统的细胞通过生殖细胞编码的受体借助保守病原 体相关性分子模式(PAMP)识别病原体并立即反应。不同的反应属于不同的细胞类型，如 分泌细胞因子(例如IL-I、IL-6、TNF-α )和趋化因子(例如IL-8/CXCL8、MIP-I α / β、 MCP-1)、效应器机理激活(噬菌作用、呼吸放电、释放杀菌物质或溶解颗粒)、表达共刺激分 子(⑶80、⑶86)以及增强表达MHC-分子。因此在一个方面，招募并活化了能够消除进入的 病原体的效应细胞，并且另一方面，适应性免疫系统的细胞接收用于它们活化的必需信号。为了改善免疫应答，CpG-寡核苷酸(CpC-ODN)已经作为一个新类型的免疫调节分 子使用。这种非甲基化的CG-基序可以在细菌DNA中找到并且对于免疫系统而言代表一种 “危险信号”。作为病原体相关性分子模式(PAMP)，它们引起先天免疫系统的非特异性激活 (Krieg,Nat.Med 2003，9 :831_835)。CpG-ODN通过细胞因子白介素-12、干扰素-χ和肿瘤 坏死因子-α诱导基于ThI的免疫应答。包含所述CpG-ODN的免疫刺激物核酸序列(ISS)具有几个碱基的长度并且不包含 表达蛋白质的可读框。ISS代表线性核酸分子，其末端是开放的(游离羟基和磷酸基)或由合成性基团保 护。细胞免疫应答的强刺激作用导致影响反馈回路，这对没有干预的患者不会产生满 意的免疫活性。以用于稳定化CpG-DNA的硫代磷酸酯骨架修饰CpC-ODN具有几个严重缺点。突出 的毒性(Heikenwalder 2004,Levin 1999)以及与蛋白质的非特异性结合(Brown 1994)属 于这些缺点。由于该原因，已经开发了新类型的共价闭合的免疫刺激性DNA(W001/07055/EP 1196178)。这些DNA分子由两个化学合成的在5’ _末端具有自我互补部分并在3’ -末端 具有回文重叠末端的DNA分子组成，从而这两个DNA分子的连接产生一个共价闭合的分子。 在非互补部分内带有CG-基序的这些DNA分子显示与CpG-ODN相似的活性(增强表达B细 胞上的表面分子 CD80、CD40、MHC 和 PBMC 分泌 IL-6、IFN- y、IFN- α IL-12、TNF α )，但是与 具有硫代磷酸酯骨架的CpC-ODN相比，它们在诱导的细胞因子的表达模式方面显示差异并 且在小鼠中显示明显较少的毒性。就调节人和动物的免疫系统活性而言，来自现有技术的这种免疫刺激性DNA具有几个缺点。不可能以所希望的程度调节、尤其激活人和动物免疫 系统的活性。根据W001/07055(如在例如附图说明图1或权利要求11所示的)的分子由形成部分 单链哑铃形状和共价闭合的DNA分子的几个脱氧核糖核苷酸支架组成，其中所述的DNA分 子在该专利技术的意义范围内命名为单体。根据WO 01/07055，由寡核苷酸制成的这些单体在 连接之前已被加热，接收来自这些寡核苷酸的相同分子，每种寡核苷酸包括一个哑铃形单 体(比较WO 01/07055的图1)。本领域技术人员知道如何解释术语由寡核苷酸组成的单 体的。技术人员知道单体可能由几个分子元件如寡核苷酸支架组成，而不失去它们作为单 体的特性(例如肌红蛋白是具有153个氨基酸的单体)。根据WO 01/07055的图1，该单体 是哑铃形状。本专利技术意义上的单体不表示由例如单个碱基组成的结构，但是表示由核苷酸 组成的的闭合哑铃形形式，其中所述核苷酸本身由几个脱氧核糖核苷酸支架组成(比较WO 01/07055的图1或权利要求11)。
技术实现思路
从目前技术水平看，本专利技术的一个目的是提供适合的免疫刺激性DNA分子，所述 分子启动改善的免疫应答，还是提供用于制造所述分子的方法以及包含所述免疫刺激性 DNA分子的疫苗。在本专利技术上下文中，免疫刺激意指，免疫系统的介体细胞和效应细胞，因此主要是 具有辅助细胞功能的目前已知胸腺细胞和细胞毒性胸腺细胞、B细胞和所谓NK(自然杀伤) 细胞、巨噬细胞和单核细胞，以及树状细胞和其前体，以及免疫系统内部具有目前为止未清 楚鉴定的功能的细胞群体，因使用核酸分子在增殖、迁移、分化或其活性方面受到刺激。免 疫调节也意指，除上述所定义意思中的一般刺激作用之外，免疫反应的类型或特征也会被 影响，无论通过影响初始或成熟免疫反应或通过相对于其特性改变建立的反应做到这一 点ο本专利技术通过分别提供寡聚和多聚非编码性核酸分子解决该目的。完全令人惊奇的 是共价闭合免疫刺激性DNA的二聚物、三聚物、五聚物或多聚物相对于从目前技术水平已 知的分子而言有令人惊讶的改善效应。专利技术的多聚分子可以由包括以下步骤的方法制造-提供5’_磷酸化寡核苷酸，-在MgCl2存在下醇沉淀或冻干，直到获得干燥残余物，随后重悬在缓冲液中。-加入T4-DNA连接酶，因此产生反应混合物，和-该反应混合物在37°C孵育至少30分钟。本专利技术的分子可以由其制造方法表征。制造方法起到定义该产物的作用。由该方 法定义的产物相对于现有技术所描述(例如WO 01/07055中的)的分子是新的。通过其制 备方法描述和要求保护的分子由其结构特性和功能特性定义，其中所述特性因本领域技术 人员应用其制造方法所致。因为通过结构特点表征是不可行的，故利用该制造方法，该分子 的制造是非常精确的。因为公开了对于本领域技术人员而言的全部必须说明，故而可以成 功地进行所要求保护的方法。该制造方法还区别于本领域已知的方法。所述新方法的使用 产生与本领域所述产物不同的产物。这通过(例如根据W001/07055图1的)单体和本发 明多聚体的性质方面的明显差异来显示。本专利技术的分子令人惊讶地比现有技术的分子更适 用于免疫刺激。如果本专利技术的分子用等同于聚丙烯酰胺凝胶电泳法的方法纯化，则它们也可以通 过在水中提供5’ -磷酸化寡脱氧核糖核苷酸制备。尤其通过用HPLC后续FPLC的联合纯 化。本领域技术人员已知通过联合几种高性能方法如HPLC或FPLC，可达到与PAGE纯化等 级类似的纯化等级。令人惊讶地，所述方法的单个步骤的时序产生了包含稳定连接的单体和至少48 个核苷酸(具有24个核苷酸的2个单体)的多聚化分子。形成的分子链不包含游离的5’ 或3’末端。通过本专利技术分子间连接作用形成的单体的特征在于_包含一个至少8个连续核苷酸的序列，该序列在适合情况下与此单体的另一部 分形成双链茎，-在这些反向互补部分之间存在至少4个核苷酸-在单链部分内部存在被细胞结构识别的CG-基序-修饰的核苷酸也可以是单链区域的一部分，其中所述的修饰核苷酸共价连接至 脂肪酸、糖或氨基酸。本专利技术的分子包含至少两个单体并且在上述提到的合成过程期间形成。单体形成 二、三、四、五或更多的分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于调节人和动物免疫系统活性的连接分子，其由包括以下步骤的方法制造：－提供５’－磷酸化寡核苷酸，－在ＭｇＣｌ２存在下醇沉淀或冻干，直到获得干燥残余物，随后重悬在缓冲液中，－加入Ｔ４－ＤＮＡ连接酶，因而产生反应混合物，并且－该反应混合物在３７℃孵育至少３０分钟。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2007-11-7 07075967.5一种用于调节人和动物免疫系统活性的连接分子，其由包括以下步骤的方法制造-提供5’-磷酸化寡核苷酸，-在MgCl2存在下醇沉淀或冻干，直到获得干燥残余物，随后重悬在缓冲液中，-加入T4-DNA连接酶，因而产生反应混合物，并且-该反应混合物在37℃孵育至少30分钟。2.根据权利要求1的分子，其特征在于所述连接分子是至少一个环元件与第二分子的 另一个环元件连接、尤其交插连接的分子，从而优选存在至少一个连接的元件。3.根据上述权利要求任一项的分子，其特征在于所述寡脱氧核糖核苷酸序列包含以下 序列a.agctgtagcagcttcggggggtatcgttcttcgtgtcgttcttagctgctacag ctgcagctgtagcagcttcggggggtatcgttcttcgtgtcgttcttagctgct acagctgc，或b.ggggttaccaccttctatagaaaacgttcttcggggcgttcttcatcggt aacccctaggggttaccaccttctatagaaaacgttcttcggggcgttct tcatcggtaaccccta，或c.ggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacc cctaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggt aaccccta,d.agggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacc ctcaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggt aacccctg，或e.ggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacc ccggcgggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggt aacccgcc,f.agggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacc ctaatgggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggt aacccatt，或g.agggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggttaac cctcaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtgg taacccctg，或h.ctaggggttaccacctacaaaaaaaaacgaaattcggggcgaagggaggtggta accc，并且其中i.所述寡脱氧核糖核苷酸序列具有20到400个核苷酸的长度。4.一种组合物，包含根据权利要求1到3任一项的分子和一种化疗药，所述化疗药选 自由抗体、烷化剂、钼类似物、插入剂、抗生素、有丝分裂抑制剂、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制 剂、抗代谢物和/或L-天冬酰胺酶、羟基脲、米托坦和/或鹅膏蕈碱组成的组。5.根据上述权利要求的组合物，其特征在于所述烷化剂选自由以下组成的组 -氮芥衍生物，特别是-环磷酰胺，_异环磷酰胺， “曲磷胺， “美法仑和/或 “苯丁酸氮芥 _烷基磺酸盐，特别是 “白消安，和/或， “苏消安-亚硝基脲，特别是 -卡莫司汀， -洛莫司汀， -尼莫司汀 -雌莫司汀和/或 _链佐星-丙卡巴胼和达卡巴嗪， “替莫唑胺和/或 -噻替派。6.根据上述权利要求任一项的组合物，其特征在于所述钼类似物由以下药物组成的-顺钼， -卡钼和/或 -奥沙利钼。7.根据上述权利要求任一项的组合物，其特征在于所述插入剂选自由以下组成的组 -蒽环霉素，特别是-多柔比星(阿霉素)， -柔红霉素， -表柔比星和/或 -去甲柔红霉素， -米托蒽醌， -安吖啶和/或 -去氧氟尿苷。8.根据上述权利要求任一项的组合物，其特征在于所述抗生素选自由以下组成的组 -博来霉素，-放线菌素D (更生霉素)和/或 -丝裂霉素。9.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：M施罗夫，B威蒂格，M施密特，J勒尔，C克洛伊斯，
申请(专利权)人：莫洛根股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]