在真核生物中生产二羧酸制造技术

本发明专利技术涉及包含下述核苷酸序列的重组真核微生物细胞，所述核苷酸序列编码能催化磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸从而产生ＡＴＰ的异源酶。本发明专利技术还涉及制备二羧酸（例如琥珀酸和富马酸）的方法，包括在合适的发酵培养基中发酵根据本发明专利技术的真核微生物细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在真核生物中生产二羧酸本专利技术涉及包含下述核苷酸序列的重组真核细胞，所述核苷酸序列编码催化磷酸 烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)转化为草酰乙酸(oxaloacetate)的酶，还涉及用于生 产二羧酸的方法。4-碳二羧酸苹果酸、富马酸和琥珀酸是大量化学品的潜在前体。例如，琥珀酸可以 被转化为1，4_ 丁二醇(BDO)、四氢呋喃和γ 丁酸内酯。衍生自琥珀酸的另一产物是通过连 接琥珀酸和BDO制造的聚酯聚合物。琥珀酸主要通过丁烷氢化的石油化学方法生产。这些方法被认为是对环境有害和 昂贵的。琥珀酸的发酵生产可能是生产琥珀酸的一种吸引人的替代性方法，其中可以使用 可再生的原料如碳源。已知大量不同的细菌如Escherichia coli和瘤胃细菌Actinobacillus、 Anaerobiospirillum、Bacteroides、Mannheimia 或 Succinimonas sp.生产玻拍酸。这些 细菌菌株的代谢改造提高了琥珀酸产量和/或生产力，或者减少了副产物形成。W02007/061590公开了用于生产苹果酸和/或琥珀酸的丙酮酸脱羧酶阴性酵母， 所述酵母用丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和苹果酸转运蛋白 (MAE)转化。尽管二羧酸的发酵生产有所改进，但是仍然需要用于发酵生产二羧酸的改进的微 生物。本专利技术的一个目的是提供用于生产二羧酸的替代性真核微生物。根据本专利技术用包含下述核苷酸序列的重组真核微生物细胞实现了这一目的，所述 核苷酸序列编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸(OAA)从而产生ATP的酶，其中所述 酶包含与SEQ ID NO =USEQ ID NO :3和/或SEQ ID NO 5的氨基酸序列具有至少50%序 列同一性的氨基酸序列。优选地，所述酶具有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性，优选地所述酶是磷酸烯醇丙酮 酸(PEP)羧激酶(E. C. 4. 1. 1. 49)。优选地，PEP羧激酶在存在可发酵的碳源或甘油时，在缺 氧或氧受限的条件下有活性。可发酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、半乳糖、棉子糖、阿拉伯糖 或木糖。发现包含本专利技术的PEP羧激酶的真核细胞是有利的，因为催化PEP转化成为OAA 的PEP羧激酶固定CO2并且产生ATP形式的能量。出人意料地发现，与野生型真核细胞生产的二羧酸量相比，根据本专利技术的重组真 核细胞生产提高量的二羧酸，例如琥珀酸和富马酸。优选地，根据本专利技术的真核细胞与不 包含下述核苷酸序列的野生型真核细胞相比，生产至少1.2、优选至少1.5、1.6、1.8、优选 至少2倍的二羧酸，所述核苷酸序列编码本专利技术的催化磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸的 酶。优选地，根据本专利技术的真核微生物细胞表达下述核苷酸序列，所述核苷酸序列编 码具有PEP羧激酶活性的酶，优选如下的PEP羧激酶，其中所述PEP羧激酶包含与SEQ ID NO 1, SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO :5的氨基酸序列具有至少55%、优选地至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性的3氨基酸氨基酸序列。优选地，PEP羧激酶包含SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :3和/或SEQ ID NO :5。序列同一性在本文中被定义为通过比较序列测定的两个或更多氨基酸(多肽或 蛋白质)序列或两个或更多核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，在比较的序列的整 个长度上比较序列同一性或相似性。在本领域中，“同一性”也表示氨基酸或核酸序列之间 的序列相关度，根据情况通过这类序列串之间的匹配测定。测定同一性的优选方法被设计为在测试的序列之间给予最大匹配。测定同一性和 相似性的方法在公众可获得的计算机程序中编码。测定两条序列之间同一性和相似性的优 选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN，公众可从NCBI和其他来源(BLAST Manual, Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894)获得。使用 BLASTP 的氨基酸序列比 较的优选参数为缺口开放11.0，缺口延伸1，Blosum 62矩阵。编码在本专利技术细胞中表达的酶的核苷酸序列也可以通过它们在中度杂交条件或 优选严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3和/或SEQ ID NO 5的PEP 羧激酶活性的酶的核苷酸序列，或与编码SEQ IDNO 14的苹果酸脱氢酶的核苷酸序列，或 与编码SEQ ID NO :16的富马酸酶的核苷酸序列杂交的能力来定义。严格杂交条件在本文 中定义为下述条件，所述条件允许至少约25个、优选至少约50个核苷酸、75或100个、优选 至少约200或更多个核苷酸的核酸序列，在约65°C的温度下，在包含约IM盐的溶液(优选 6xSSC(氯化钠、柠檬酸钠))或具有与之相当的离子强度的任何其他溶液中杂交，并在65°C 下，在包含约0. IM或更少盐、优选0. 2xSSC的溶液或具有与之相当的离子强度的任何其他 溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，并优选地至少进行1小时洗涤， 其中至少将洗涤溶液更换两次。这些条件通常会允许具有约90%或更多序列同一性的序列 的特异性杂交。中度条件在本文中定义为下述条件，所述条件允许至少50个核苷酸、优选至少约 200或更多个核苷酸的核酸序列，在约45°C的温度下，在包含约IM盐的溶液(优选6x SSC) 或具有与之相当的离子强度的任何其他溶液中杂交，并在室温下，在包含约IM盐的溶液 (优选6x SSC)或具有与之相当的离子强度的任何其他溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进 行，即至少进行10小时，并优选地至少进行1小时洗涤，其中至少将洗涤溶液更换两次。这 些条件通常会允许具有多达50%序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员应当能 够调整这些杂交条件，从而特异性地鉴定同一性在50%和90%之间变化的序列。根据本专利技术的重组真核微生物细胞被定义为下述细胞，所述细胞含有不天然存在 于该真核细胞中的核苷酸序列或用其转化或遗传修饰，或者含有额外的一个或多个拷贝的 内源核酸序列。野生型真核细胞在本文中被定义为重组细胞的亲本细胞。用于表示给定(重组)核酸或多肽分子和给定宿主生物或宿主细胞之间相互关系 时，术语“同源的”被理解为表示所述核酸或多肽分子天然地由相同物种的宿主细胞或生物 生产，优选由相同变种或菌株的宿主细胞或生物生产。对于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源的”是指下述核酸或蛋白质，所 述核酸或蛋白质不作为其出现的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在， 或者存在于与其天然存在的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个不同位置中。 异源核酸或蛋白质对引入它的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或合成生产或重组4生产。在本文中使用时，术语“基因”表示含有核酸聚合酶(在真核生物中为RNA聚合酶 II)的模板的核酸序列。基因被转录为mRNA，随后被翻译为蛋白质。在本文中使用时，术语“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷 酸多聚体，即多核苷酸，除非另有限制，其包本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含下述核苷酸序列的重组真核微生物细胞，所述核苷酸序列编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化成为草酰乙酸从而产生ＡＴＰ的酶，其中所述酶包含与ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３和／或ＳＥＱＩＤＮＯ：５的氨基酸序列具有至少５０％序列同一性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2007-11-20 07121117.1;EP 2007-11-20 07121120.5;包含下述核苷酸序列的重组真核微生物细胞，所述核苷酸序列编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化成为草酰乙酸从而产生ATP的酶，其中所述酶包含与SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和/或SEQ ID NO5的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列。2.根据权利要求1的细胞，其中所述酶是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。3.根据权利要求1或2的细胞，其中所述酶是异源酶，优选地来自于细菌。4.根据权利要求1到3中任一项的细胞，其中所述核苷酸序列在胞质溶胶中表达。5.根据权利要求1到4中任一项的细胞，其中所述细胞是酵母，优选地为 Saccharomyces cerevsiae， 或是丝状真菌如Aspergillus niger06.根据权利要求1到5中任一项的细胞，其中所述细胞过表达编码丙酮酸羧化酶的核 苷酸序列。7.根据权利要求1到6中任一项的细胞，其中所述细胞还包含编码苹果酸脱氢酶的核 苷酸序列，其中在编码苹果酸脱氢酶的核苷酸序列表达后...

【专利技术属性】
技术研发人员：瑞内维尔瓦尔，吴亮，罗波图斯安东尼厄斯戴维尔德，科尼利斯玛丽亚雅各布斯沙吉，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：NL