使用源自 Idiomarina loihiensis的苯丙氨酸解氨酶从肉桂酸衍生物生产光学活性苯丙氨酸化合物的方法技术

本发明专利技术涉及制备对映异构体富集的苯丙氨酸化合物的工艺，所述工艺 通过在存在立体选择性苯丙氨酸解氨酶时用相应的肉桂酸与氨基供体反应 来实现，所述苯丙氨酸解氨酶与SEQ ID No.4(来自Idiomarina loihiensis 的PAL的氨基酸序列)具有至少50％的序列同一性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用源自/Aoman'fl /o//^w\s的苯丙氨酸解氨酶从肉桂酸衍生物生产光学活性苯丙氨酸化合物的方法
本专利技术涉及制备对映异构体富集的(enantiomerically enriched)苯丙 氨酸化合物的方法，其中使相应的肉桂酸在存在立体选择性苯丙氨酸解氨 酶时与氨基供体反应。对映异构体富集的苯丙氨酸化合物是例如药物制品的重要中间体，尤 其是在对血管紧张素I转化酶抑制剂(ACE)的制备中，ACE被用于治疗高 血压(high blood pressure,也作hypertension)。例如，光学活性的(S)-吲 哚啉-2-羧酸((S)陽indoline-2-carboxylic acid)(可通过(S)画2-氯苯丙氨酸闭环制 备)可用于制备[2S-[1[I^(R, 2a， 3ab, 7ab]]-l-[2-[[l-(乙氧羰基)丁基]氨基]-1- 氧代丙基]八氢-lH-吲哚-2-羧酸，后者也作为商品名培哚普利(Perind叩ril) 己知，其可用作抗高血压药(ACE抑制剂)或强心药(cardiotonic)活性成 分。其它有用的应用为例如喷托普禾iJ(Pentopril)和吲哚普利(Indolapril)。从WO2006/069799 Al可获知制备对映异构体富集的苯丙氨酸化合物 的工艺，其中在一个特定的实施例中，通过在存在来自兄g/t^'m's的苯丙 氨酸氨裂解酶(PAL)时将3-(2-氯-苯基)丙烯酸与水性NH3反应，来制备(S)-2- 氨基-3-(2-氯-苯基)-丙酸。来自Wotfotora/fl g/wm、的氨基酸序列可见 WO 01/11071 A2和本文的SEQ ID NO. 9。WO2006/069799 Al中所述工艺的缺点是发生底物抑制。因此，该工 艺需要在低浓度下运行。因此为了生产可接受量的产物，需要大体积或复 杂的补料方案，使得从商业观点来看该工艺较不吸引人。因此，提供下述工艺是本专利技术的一个目的，所述工艺用于制备苯丙氨 酸化合物，其中底物抑制被降低。该目的已通过工艺方法达成，所述工艺用于制备对映异构体富集的苯 丙氨酸化合物，其使相应的肉桂酸在存在立体选择性苯丙氨酸解氨酶时与 氨基供体反应，所述苯丙氨酸解氨酶与SEQ ID NO. 4具有至少50%的序 列同一性。因此，本专利技术的工艺提供了用于制备苯丙氨酸化合物的改进的和/或有商业吸引力的工艺。通过使用与SEQ ID NO. 4具有至少50%的序列同一 性的PAL，底物抑制得以降低(即随着底物浓度的提高，酶最初活性的降 低)。另外，在五.co/Z中容易地过表达了与SEQ ID NO. 4具有至少50% 同一性的苯丙氨酸解氨酶(PAL)。与SEQ ID NO. 4具有至少50%同一性的 PAL与来自/ . g/z^>^的PAL相比的另一优点是它们具有更高的活性。在使用Clone Manager 6 (6.00版/align Plus 4, 4.10版(Scientific & Educational Software))的序列比对研究中，使用BLOSUM62作为评分矩阵 来测定本文定义的％同一性。优选地，在本专利技术的工艺中，使用的PAL与SEQ ID NO. 4具有至少 50%，更优选地至少53%，更优选地至少55%，更优选地至少57%，进一 步更优选地至少60%，进一步更优选地至少62%，进一步更优选地至少 65%，进一步更优选地至少70%，尤其是至少75%,更尤其是至少80%， 更尤其是至少85%，更尤其是至少90%，进一步更尤其是至少95%，进一 步更尤其是至少97%，进一步更尤其是至少98%，进一步更尤其是至少 99%，最尤其是100%的序列同一性。本专利技术工艺中可使用的PAL序列可由本领域技术人员容易地鉴定，例 如在数据库(例如NCBI数据库)中使用BLAST搜索。编码这些PAL序 列的核酸序列可容易地被鉴定，例如使用可通过NCBI的BLAST获得的 程序来进行。或者，也可以按照针对期望的宿主细胞来说优选或优化的密 码子选择，例如由商业公司如GenScript或DNA 2.0，从氨基酸序列开始 合成核酸序列。编码本专利技术工艺中使用的PAL酶的氨基酸序列的核酸序列 可以被克隆在合适的载体中，在引入合适的宿主后，可根据本领域技术人 员已知的标准克隆和表达技术(例如如Sambrook， J., Fritsh, E. F.， and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd， ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989中所述)，来(过)表达该序列，产生与SEQ ID NO. 4具有至 少50%序列同一性的PAL酶。在本专利技术的范围内，PAL (苯丙氨酸解氨酶)被定义为具有苯丙氨酸5解氨酶活性(即催化肉桂酸到苯丙氨酸的可逆非还原性氨基化的能力)的 酶。HAL (组氨酸解氨酶)被定义为具有组氨酸解氨酶活性(即催化尿刊 酸到组氨酸的可逆非还原性氨基化的能力)的酶。优选地，在本专利技术的工艺中生产的苯丙氨酸化合物是式(l)的化合物或 其盐，其中Y表示羟基、具有1-10个碳原子的取代的或非取代的垸氧基、 取代的或非取代的芳氧基、或胺基或胺残基-NHR (其中R为包含1-10个 碳原子和任选地一个或多个杂原子的垸芳基(akaryl)、垸基、芳垸基、芳 基)，且其中Z代表芳基上的一个或多个取代基，其选自氢、羟基、具有 1-10个碳原子的任选含有一个或多个杂原子的任选被取代的环状或非环状 脂肪基、具有l-10个碳原子的任选被取代的脂肪族杂环基、任选被取代的 (杂)芳基、具有1-10个碳原子的任选被取代的烷氧基、卤素原子、胺基、 硝基、羧酸、羧酸酯、羧酸酰胺、腈或三氟甲基。在Z是环状或非环状的 脂肪基、脂肪族杂环基、(杂)芳基或烷氧基的情况下，任选的取代为， 在Y是烷氧基或芳氧基的情况下，任选的取代可例如选自三卤化物，例如 三氟甲基、三氯甲基；卤素原子，例如氟化物、氯化物或碘化物；胺基， 例如甲胺、二甲胺、苄胺、乙胺、丙胺、苯胺、4-氟苯胺；垸氧基或芳氧 基，例如甲氧基、乙氧基、异丙氧基、苄氧基、苯氧基、4-氟苯氧基、3-氟苯氧基、2-氟苯氧基；硫醚，例如甲基硫醚、乙基硫醚、苄基硫醚；三 卤素垸基醚(trihaloalkylether)，例如三氟甲基醚；芳基或杂芳基，例如苯 基、4-氟苯基、3-氟苯基、2-氟苯基、2-三氟甲基苯基、3-三氟甲基苯基、 4-三氟甲基苯基、噻吩、呋喃、吡唑、吡咯(pyrole)、咪唑等等。优选的 是其中Z为氢、卤素原子、三氟甲基、羟基、甲氧基或腈且Y为羟基的化 合物。更优选地，在本专利技术的工艺中生产的苯丙氨酸化合物是式(2)的化合物 或其盐，<formula>formula see original document page 7</formula>其中Y如上文针对式(l)所定义，且其中Z如上文针对式(l)所定义， 且其中X代表离去基团，例如选自氟化本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备对映异构体富集的苯丙氨酸化合物的工艺，所述工艺通过用相应的肉桂酸在存在立体选择性苯丙氨酸解氨酶时与氨基供体反应来实现，所述苯丙氨酸解氨酶与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４具有至少５０％的序列同一性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2006.9.12 EP 06019071.71.制备对映异构体富集的苯丙氨酸化合物的工艺，所述工艺通过用相应的肉桂酸在存在立体选择性苯丙氨酸解氨酶时与氨基供体反应来实现，所述苯丙氨酸解氨酶与SEQ ID NO.4具有至少50％的序列同一性。2. 根据权利要求1的工艺，其中所述苯丙氨酸化合物是式(l)的化合物 或其盐，其中Y表示羟基、具有1-10个碳原子的取代的或非取代的垸氧基、 取代的或非取代的芳氧基、或胺残基，并且其中，Z代表芳基上的一个或 多个取代基，其选自氢、羟基、具有l-10个碳原子的任选地被取代的环状 或非环状脂肪基、具有l-10个碳原子的任选地被取代的脂肪族杂环基、任 选地被取代的(杂)芳基、具有1-10个碳原子的任选地被取代的烷氧基、卤 素原子、胺基、硝基、羧酸、羧酸酯、羧酸酰胺、腈或三氟甲基。3.根据权利要求1的工艺，其中所述苯丙氨酸化合物是式(2)的化合物 或其盐，<formula>formula see original document page 2</formula>(2)其中Z代表芳基上的一个或多个取代基，其选自氢、羟基、具有1-10 个碳原子的任选地被取代的环状或非环状脂肪基、具有l-10个碳原子的任选地被取代的脂肪族杂环...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗里斯科·伯纳德·简·范阿斯玛，纳特斯卡·斯里尼吉，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：NL