提高真菌细胞中基因表达的方法技术

本发明专利技术涉及产生多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的培养基 中培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞包含：含有编码所述多肽的核 酸序列的第一多核苷酸，其与包含铜响应性上游激活序列的铜诱导型启动子 序列可操作地连接，该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子激活； 和第二多核苷酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个 (几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多 肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列 的铜诱导型转录；和第三多核苷酸，其包含至少一个拷贝的编码铜依赖性反 式作用转录因子的基因；和(b)从培养基分离所述多肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
专利
本专利技术涉及提高真菌细胞中编码多肽的基因的表达的方法。 相关技术描述在真菌宿主细胞(例如酵母或丝状真菌细胞)中重组产生天然或外源多肽可以为以商业相关量制备多肽提供更理想的运载体(vehicle)。天然或外源多肽的重组产生通常通过构建表达盒(expression cassette)来 完成，在所述表达盒中将编码所述多肽的DNA置于启动子的表达调控之下， 该启动子来自一种受调节的基因。通常通过质粒介导的转化将表达盒引入宿 主细胞。然后通过在使表达盒中所含启动子正确发挥功能所必需的诱导条件 下培养受转化的宿主细胞来实现多肽的产生。用于在真菌宿主细胞中重组产生多肽的新表达构建体和载体的开发通 常要求高效启动子的可用性，所述高效启动子适合用于在所述宿主细胞中调 控所述多肽的表达。然而，即使是最广为人知的启动子对于表达感兴趣的基 因也可能是低效的(ine伍cient)。许多启动子对于受到的能够提高它们的效率的调节是敏感的。指名为 Ct/尸7的酿酒酵母(Sacc/wram少ces cwevWae)金属辟u蛋白基因由铜通过特异性 启动子区UASCW7 (上游激活序列)转录激活，据报道UASo;w位于相对于 Ct/尸/转录激活位点的-105和-230之间(Thiele和Hamer, 1986, Mo/. CW/.说o/. 6: 1158-1163; Zhou和Thiele， 1993,所o/actow 4: 105-115)。酿酒酵母的Ace 1 蛋白(Acelp)负责在铜离子(Thiele, 1988， Mo/, Ce〃.所o/. 8: 2745-2752)或银离 子(Furst等，1988， Ce//55: 705-717)的存在下诱导酵母金属硫蛋白基因C77P7。 Acelp氨基末端的一半富含碱性氨基酸残基和半胱氨酸，并且在Cu(I)或Ag(I) 存在下与C77尸7上游激活序列特异性地结合，而在不存在Cu(I)或Ag(I)时则 不与Ct/尸7上游激活序列特异性地结合(Furst等，1988，见上文)。Thiele和 Hamer, 1986， A/o/ecw/w fld CW/w/ar历o/o^y 6: 1158-1163 乂>开了串联重复上5;摔调4空序歹'J(tandemly duplicated upstream control sequences)介导酉良酒酵母^同-金属硫蛋白基因的铜诱导型转录，并且这些元件之一的合成形式(synthetic version)当以两个串联拷贝存在时为异源启动子赋予铜诱导性。Gralla等，1991, PA^S腦88: 8558-8562公开了 Acelp激活酵母铜、锌 的超氧化物歧化酶基因的表达。Lapinskas等，I993, O^rem Geeri 24: 388-393公开了 Acelp激活酿酒酵母胞质过氧化氪酶基因的表达。Mehra等，1989， 历o/o&ca/ CT/em/^y 264: 19747-19753描述了对来自 光滑念珠菌(Ca^^ag/a6rato)金属硫蛋白基因的克隆和该基因的序列。Zhou 和Thiele, 1991, /WAS 88: 6112-6116描述了来自光滑念珠菌的由金属激 活的转录因子基因的分离。Thorvaldsen等，1993, /所o/og!'ca/ CTzew^^y 268: 12512-12518公开了通过对指名为M7Y、 M7Y/a和M777Z 的光滑念珠 菌金属硫蛋白基因的调节。Mascorro-Gallardo等，1996， 172: 169-170公开了调节酿酒酵母中基 因表达的基于CT/户/启动子的载体的构建。Macreadie等，1989, P/wmzW 21: 147-150公开了一系列利用酿酒酵母Cf/P/基因的酵母表达载体。Hottiger 等，1994, 10: 283-296公开了 CT/尸7启动子的生理学特征和过表达它的 转录激活子Acelp的后果。本专利技术的一个目的是提供改进的在真菌宿主细胞中产生多肽的方法。专利技术概述本专利技术涉及用于产生多肽的方法，其包括(a)在有益于产生所述多肽的 培养基中培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞包含含有编码所述多 肽的核酸序列的第一多核苷酸，其与包含铜响应性上游激活序列的铜诱导型 启动子序列可操作地连接，该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子 激活；和第二多核芬酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个 或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码 所述多肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动 子序列的铜诱导型转录；和第三多核苷酸，其包含至少一个拷贝的编码铜依 赖性反式作用转录因子的基因；和(b)从培养基分离所述多肽。多肽对于真菌 宿主细胞可以是天然的或外源的。本专利技术还涉及真菌宿主细胞，其包含含有编码多肽的核酸序列的第一6连接，该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子激活；和第二多核香 酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个(几个)额外的 铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多肽的核酸序列 是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列的铜诱导型转录；和第三多核苷酸，其包含至少一个拷贝的编码铜依赖性反式作用转录因 子的基因。本专利技术还涉及核酸构建体和载体，所述核酸构建体和载体包含含有编 码多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其与包含铜响应性上游激活序列的铜诱 导型启动子序列可操作地连接，该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录 因子激活；和第二多核普酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的 一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于 编码所述多肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该 启动子序列的铜诱导型转录。附图简述附图说明图1显示pBM128a的限制图谱。 图2显示pMB1537的限制图语。 图3显示pBM126a的限制图语。 图4显示pMB1539的限制图谱。 图5显示p几inl68的限制图谱。 图6显示pBM142c的限制图谱。 图7显示pBM143b的限制图谱。 图8显示pMB1682的限制图谱。 图9显示pJLinl95的限制图谱。 图10显示pBM163a的限制图i昝。 图11显示pBM65a的限制图谱。 图12显示pBM168a的限制图i普。 图13显示pBM69a的限制图谱。 图14显示pBM171a的限制图谱。 图15显示pBM70a的限制图i昝。专利技术详述本专利技术涉及产生多肽的方法，其包括(a)在有益于产生所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞包含含有编码所述多肽的核 酸序列的第一多核苷酸，其与包含铜响应性上游激活序列的铜诱导型启动子 序列可操作地连接，该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子激活； 和第二多核苦酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个 (几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多 肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列 的铜诱导型转录；和第三多核苷酸，其包含至少一个拷贝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于产生多肽的方法，其包括：　（ａ）在有益于产生所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞包含：含有编码所述多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其与包含铜响应性上游激活序列的铜诱导型启动子序列可操作地连接，该上游激活序列通 过铜依赖性反式作用转录因子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个（几个）额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列的铜诱导型转录；和第三多核苷酸，其包含至少一个拷贝的编码铜依赖性反式作用转录因子的基因；和　（ｂ）从培养基分离所述多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2006.7.14 US 60/831,1511. 一种用于产生多肽的方法，其包括(a)在有益于产生所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞包含含有编码所述多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其与包含铜响应性上游激活序列的铜诱导型启动子序列可操作地连接，该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列的铜诱导型转录；和第三多核苷酸，其包含至少一个拷贝的编码铜依赖性反式作用转录因子的基因；和(b)从培养基分离所述多肽。2. 权利要求1的方法，其中所述铜诱导型启动子序列是从选自下组的基 因获得的酿酒酵母金属硫蛋白基因、酿酒酵母超氧化物歧化酶基因、酉良酒 酵母胞质过氧化氢酶基因、酿酒酵母铜耐受抑制基因、光滑念珠菌金属硫蛋 白基因、粗糙脉孢菌金属硫蛋白基因、解脂西洋蓍霉(Jam w'a Z^o/,'ca)金 属硫蛋白基因、双孢蘑菇金属硫蛋白基因、灰梨孢菌金属疏蛋白基因和鹅柄 孢壳菌金属硫蛋白基因。3. 权利要求l的方法，其中所述一个或多个(几个)额外的铜响应性上游 激活序列是从选自下组的基因获得的酿酒酵母金属硫蛋白基因、酿酒酵母 超氧化物歧化酶基因、酿酒酵母胞质过氧化氬酶基因、酿酒酵母铜耐受抑制 基因、光滑念珠菌金属硫蛋白基因、粗糙脉孢菌金属硫蛋白基因、解脂西洋 蓍霉金属硫蛋白基因、双孢蘑菇金属硫蛋白基因、灰梨孢菌金属硫蛋白基因、 鵝柄孢壳菌金属硫蛋白基因，和它们的组合。4. 权利要求l的方法，其中所述一个或多个(几个)额外的铜响应性上游 激活序列是SEQ ID NO: 46和/或SEQ ID NO: 47。5. 权利要求l的方法，其中所述铜依赖性反式作用转录因子基因选自下 组酿酒酵母^CW基因、光滑念珠菌^M77基因、解脂西洋蓍霉CRF1基 因(登录号P45815)、粟酒裂殖酵母CUF2基因(登录号094588)、酿酒酵母 HAA1基因(登录号Q12753)和烟曲霉(A/ e^7/w/wm/ga^s)铜拳DNA结合域 蛋白基因(登录号Q4WN33)。6. 权利要求l的方法，其中所述真菌宿主细胞包含一个或多个(几个)拷 贝的第一多核苷酸。7. 权利要求l的方法，其中所述多肽选自下组抗原、酶、生长因子、 激素、免疫调节剂、神经递质、受体、报道蛋白、结构蛋白和转录因子。8. 权利要求1的方法，其中所述多肽是白蛋白、胶原、原弹性蛋白、弹 性蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴比·亚弗，巴巴拉·彻里，马兹·E·比约恩瓦德，
申请(专利权)人：诺维信股份有限公司，诺维信公司，
类型：发明
国别省市：US