来自艰难梭菌的新型多糖免疫原制造技术

本申请涉及艰难梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ?ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）细胞表面多糖、包含艰难梭菌细胞表面多糖的组合物，并且本申请包括它们的药盒、方法和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自艰难梭菌的新型多糖免疫原本申请涉及新型免疫原性细胞表面多糖及其方法和用途。
技术介绍
艰难梭菌(Clostridium difficile)是一种革兰氏阳性细菌，已知它是肠道疾 病的病因。它是抗生素相关性腹泻和假膜性结肠炎的主要病因(Kn00p，F.C. ；Owens, M.； Crocker, I. C. ；Clin. Microbiol. Rev. 6，1993，251-265)。与艰难梭菌相关的暴发流行的 频率和严重性近年来有所增加(P印in，J. ；Valiquette, L. ；Alary, M. E. ；Villemure, P.； Pelletier, A. ；Forget, K. ；P印in，K. ；Chouinard, D. ;JAMC. 171，2004，466-472)。大多数 被摄入的有生长力的艰难梭菌细胞都被胃中存在的酸性环境杀死。然而，孢子能幸免于此， 并且在曝露于胆汁酸后，可以在小肠中萌发。由于药物治疗诸如抗生素的使用和化学疗法 而造成的肠道中正常微生物细胞水平的降低可使艰难梭菌繁殖。在人类中，艰难梭菌相关的腹泻(CDAD)是医院相关性腹泻和抗菌剂相关性腹泻 最常见的诊断病因。传统上，老年患者和已接受住院治疗、胃肠道外科手术或接触抗生素 的患者罹患CDAD的风险较高。在美国，估计的艰难梭菌相关的疾病的病例数量每年超过 250, 000(ffikkins TD 和 LyerlyDM，2003，J. Clin Hosp Infect. 48 :81)，全部的附加卫生保 健费用接近每年十亿美元(Kyne L等人，2002，Clin Infect Dis 34:346-353)。在过去五年中，已经观察到CDAD发病率出乎意料地增加。这还涉及较高比率的 严重CDAD、治疗失败和死亡。在年轻患者和无传统风险因素的患者中，更频繁地鉴定出重 症患者。大部分这种变化与称为核糖核酸型(ribotype)027(也称为北美去氧核糖核酸型 (pulsotype)l(NAPl)和BI)的暴发克隆的世界性传播有关。艰难梭菌的预防基于患者隔 离、改进卫生设施、改进感染控制和抗菌剂限制，所有这些都涉及高的医疗保健费用。此外， 抗生素的预防性使用已经用于预防感染；然而，这导致疾病的发病率增加。由于对甲硝唑 (主要的第一线治疗药物)的反应正在变得不可预知，艰难梭菌感染的治疗也成问题。万古 霉素(替代的选择)很昂贵并且它的使用引起有关出现抗万古霉素肠球菌和其它抗万古霉 素生物体的忧虑。CDAD在许多动物物种诸如马和猪中也是重要的问题。它还可以成为其它物种的病 因。有一个担忧是，艰难梭菌可以从动物传播到人，因为从动物分离出的艰难梭菌的类型经 常与在人中发现的类型相同，包括暴发菌株核糖核酸型027。根据在零售肉样品中发现艰难 梭菌，这种担忧已经加剧。报导的CDAD在增加的发病率、其再发率和其对发病率和死亡率的影响，以及有关 治疗和为限制其传播而进行的适当的隔离操作的费用，使得对有效的CDAD预防方法的需 要变得清晰。一个称为核糖核酸型027或NAP1的具体菌株，已经成为国际上散发病和流行病 的重要病因。已经报导了具有高发病率、高死亡率、治疗反应性差、高复发率的严重暴发流 行。该菌株产生3种主要毒素毒素A、毒素B和CDT (二元毒素)。它还缺失号称的毒素 调节基因，该缺失似乎至少在体外增加了毒素的产生(Just，I. ；Selzer, J. ；ffilm, M. ；von Eichel-Streiber,C. ；Mann,M. ；Aktories,K. ；Nature. 375，1995，500—5033)。人们发现，该产芽孢细菌通过细胞表面多糖抵抗吞噬作用。Poxton 禾口 Cartmill(Poxton, I. R ；Cartmill ；T. D. J Gen Microbiol. 1982,128, 1365-1370)描述了从艰难梭菌菌株NCTC 11223提取的两种制剂的糖组成。观察到，通过用 NaOH处理细胞得到的物质含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖胺和磷酸酯和其它，通过用苯酚处理 细胞提取的物质含有葡萄糖、葡糖胺、磷酸酯和脂肪酸。在同一工作中，还观察到，两种制剂 都与污泥梭状芽孢杆菌(Clostridium sordellii)抗血清发生交叉反应。人们越来越需要开发抗艰难梭菌感染的人类疫苗和动物疫苗，以便预防CDAD 或预防复发。此外，需要对动物接种疫苗以便预防动物疾病并减少艰难梭菌的散发 (shedding)以便降低动物传染病传播的风险。专利技术概述本申请公开了新型艰难梭菌细胞表面多糖，包括它们的共价化学结构，这些新型 多糖用于免疫原性组合物、抗艰难梭菌疫苗制剂和/或用作诊断标记。因此，本申请包括分离的免疫原性艰难梭菌细胞表面多糖。在一个实施方案中，所述细胞表面多糖包含式I的重复的五糖单位— 4)-a Rha-(1 — 3)_3Glc_(l — 4)-a Glc_(l — 2)-a Glc_(l — P3t(I)a Rha-(1其中，Rha是鼠李糖，P是磷酸糖酯(glycosyl phosphate)，且Glc是葡萄糖或其 免疫原性片段。在另一个实施方案中，所述细胞表面多糖是式PS-I的化合物[ — 4)-a Rha-(1 — 3)-^Glc-(l — 4)-a Glc_(l — 2)-a Glc_(l — P]n3丨(PS-I)a Rha-(1其中，n是1-1000的整数，Rha是鼠李糖，P是糖基磷酸酯，且Glc是葡萄糖或其免 疫原性片段。在另一个实施方案中，所述细胞表面多糖包含式II的重复的六糖单位U Glc- (1 U GalNAc- (1 — 4) - a Glc- (1 U GalNAc- (1 — 3) - a Man-(1 — P3个(II)3Glc_(l其中，Glc是葡萄糖，GalNAc是N_乙酰半乳糖胺，P是糖基磷酸酯，且Man是甘露 糖或其免疫原性片段。在另一个实施方案中，所述细胞表面多糖是式PS-II的化合物[ — 6) - 3 Glc- (1 — 3) - 3 GalNAc- (1 — 4) - a Glc— (1 — 4) - 3 GalNAc- (1 — 3) - a Man -(1 — P]n73个(PS-II)3Glc_(l其中，n是1-1000的整数，Glc是葡萄糖，GalNAc是N_乙酰半乳糖胺，P是糖基磷 酸酯，且Man是甘露糖或其免疫原性片段。在另一个实施方案中，所述细胞表面多糖是式PS-III的化合物，所述化合物在其 共价化学结构中包含甘油(Gro)、糖醇磷酸酯(P)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。本申请的另一个方面是艰难梭菌细胞表面多糖混合物，其包含一种或多种艰难梭 菌细胞表面多糖。本申请的另一个方面是免疫原性组合物，其包含一种或多种艰难梭菌细胞表面多 糖。本申请的再一个方面是疫苗组合物，其包含一种或多种艰难梭菌细胞表面多糖。本申请的另一个方面是药盒，其包含本文中公开的细胞表面多糖、或本文中公开 的细胞表面多糖混合物、或本文中公开的免疫原性组合物、或本文中公开的疫苗组合物，以 及使用说明。本申请的另一个方面是诱导个体的抗艰难梭菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的免疫原性艰难梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）细胞表面多糖。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-9-11 60/971,411分离的免疫原性艰难梭菌(Clostridium difficile)细胞表面多糖。2.权利要求1的细胞表面多糖，其包含式(I)的重复的五糖单位—4) - a Rha- (1 — 3) - 3 Glc— (1 — 4) - a Glc— (1 — 2) - a Glc— (1 — P3个a)a Rha-(1其中，Rha是鼠李糖，P是糖基磷酸酯，且Glc是葡萄糖或其免疫原性片段。3.权利要求1或2的细胞表面多糖，其中所述多糖是式(PS-I)的化合物 [—4)-a Rha-(1 — 3)-^Glc-(l — 4)-a Glc—(1 — 2)-a Glc—(1 — P]n3个(PS-I)a Rha-(1其中，n是1-1000的整数，Rha是鼠李糖，P是糖基磷酸酯，且Glc是葡萄糖或其免疫原 性片段。4.权利要求2或3的细胞表面多糖，其中所述鼠李糖和葡萄糖以吡喃糖构象存在。5.权利要求3的细胞表面多糖，其中n是1-100的整数。6.权利要求3的细胞表面多糖，其中n是2-100的整数。7.权利要求3的细胞表面多糖，其中n是25-100的整数。8.权利要求1的细胞表面多糖，其中所述多糖包含式(II)的重复的六糖单位—6) - 3 Glc- (1 — 3) - 3 GalNAc- (1 — 4) - a Glc- (1 — 4) - 3 GalNAc— (1 — 3) - a Man- (1 —P3个(II)3Glc-(l其中，Glc是葡萄糖，GalNAc是N_乙酰半乳糖胺，P是糖基磷酸酯，且Man是甘露糖或 其免疫原性片段。9.权利要求1或8的细胞表面多糖，其中所述多糖是式(PS-II)的化合物[—6) - 3 Glc- (1 — 3) - 3 GalNAc- (1 — 4) - a Glc— (1 — 4) - 3 GalNAc— (1 — 3) - a Man— (1 —P]n3个(PS-II)3Glc-(l其中，n是1-1000的整数，Glc是葡萄糖，GalNAc是N-乙酰半乳糖胺，P是糖基磷酸酯， 且Man是甘露糖或其免疫原性片段。10.权利要求8或9的细胞表面多糖，其中所述葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和甘露糖以吡 喃糖构象存在。11.权利要求9的细胞表面多糖，其中n是1-100的整数。12.权利要求9的细胞表面多糖，其中n是2-100的整数。13.权利要求9的细胞表面多糖，其中n是25-100的整数。14.权利要求1的细胞表面多糖，其中所述多糖在其共价化学结构中包含甘油、糖醇磷 酸酯、葡萄糖和N-乙酰葡糖胺。15.权利要求1-14中任意一项的细胞表面多糖，其中所述多糖与载体分子缀合。16.权利要求15的细胞表面多糖，其中所述载体分子是BSA、CRM197、MIEP、白喉类毒素、 破伤风类毒素或得自博德特菌属的蛋白质。17.权利要求1的细胞表面多糖，其如下获得使艰难梭菌细菌在适当的培养基中生 长，分离细菌细胞与所述培养基，通过在使细胞表面多糖从细胞表面物质断裂的条件下进 行弱酸处理来提取所述多糖，并且纯化提取的细胞表面多糖。18.细胞表面多糖混合物，其包含以下中的至少两种a)权利要求2-7中任意一项定义的多糖；或b)权利要求8-13中任意一项定义的多糖；或c)权利要求14定义的多糖；其中所述细胞表面多糖混合物包含任意组合的、a)、b)或c)中的细胞表面多糖中的至 少两禾中。19.权利要求18的细胞表面多糖混合物，其中所述混合物包含权利要求2-7中任意一 项定义的多糖和权利要求8-13中任意一项定义的多糖。20.权利要求18或19的细胞表面多糖混合物，其中所述多糖中的一种或多种与载体分子缀合。21.权利要求20的细胞表面多糖混合物，其中所述载体分子是85々、0^197、11记？、白喉 类毒素、破伤风类毒素或得自博德特菌属的蛋白质。22.免疫原性组合物，其包含权利要求1-17中任意一项的细胞表面多糖、和药学上可 接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或它们的混合物。23.免疫原性组合物混合物，其包含权利要求18-21中任意一项的细胞表面多糖混合 物、和药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或它们的混合物。24.权利要求22或23的免疫原性组合物，其还包含免疫刺激组分，诸如佐剂。25.疫苗组合物，其包含权利要求1-17中任意一项的细胞表面多糖、和药学上可接受 的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或它们的混合物。26.疫苗组合物混合物，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：MA蒙蒂罗，J加内沙皮莱，
申请(专利权)人：圭尔夫大学，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]