用于体内基因输送的自组装胶束样纳米颗粒制造技术

本发明专利技术提供了包含核酸并适合用作体内核酸输送剂的纳米颗粒。本发明专利技术纳米颗粒使用如聚乙烯和磷脂等聚阳离子共价缀合物。最终的包含ＤＮＡ的纳米颗粒具有泡状结构，复合物核心被混合的脂质／ＰＥＩ－脂质单层包裹，其制备简单，承载能力高，在体内稳定。本发明专利技术纳米颗粒有良好的体内稳定性和延长的血液循环时间，能够有效地将基因输送到生物靶位处，如肿瘤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于体内基因输送的自组装胶束样纳米颗粒相关申请的交叉引用本专利技术要求2007年11月9日提交的，名为基因输送纳米颗粒的美国临时申请 No. 61/002，626号的优先权，该申请整体纳入本文作为参考。关于联邦政府资助研究或开发的声明本专利技术的研究是使用国立卫生研究院No. R01HL55519号拨款，在美国政府支持下 进行的。因此，美国政府拥有本专利技术的某些权利。
技术介绍
体内基因治疗依赖于基于DNA的药物的输送，形式可以是将寡核苷酸(反义寡聚 脱氧核苷酸(ODN)SiRNA)或者整个基因(质粒DNA)输送进入其在细胞内起作用的位置。除 了少数可以局部施药的例外情况，基因治疗的广泛临床应用还需要发展非侵入性的输送方 法。非病毒系统是一种理想的DNA载体，因为其操作安全、简单，而且费用低于病毒系统。在非病毒基因输送系统中，已经研究了基于聚合物的复合物和基于脂质的系统， 脂质体复合物或包载DNA脂质体，但其在临床应用中显示出局限性。这主要是由于其缺乏 体内稳定性以致不能在治疗水平上输送基因治疗剂到达靶位置。结合了基于聚合物的系统 和基于脂质的系统的三级脂质体系统也已经被研究。其中，包封了 PEI/DNA复合物的脂质 体纳米颗粒，如bioPSL或pSPLP，已经被计划和测试在体内应用，得到结果是有希望的。然 而，尽管在体内稳定而且达到靶位置的循环时间长，组合系统包括复杂耗时的制备步骤而 且承载能力低。阳离子聚合物聚乙烯亚胺(聚乙烯亚胺，PEI)及其衍生物已经被广泛的研究应用 于基因输送[1-5]。PEI具有独特的优势，其在合成的聚阳离子中有最高的正电荷密度，使 其可以在静电作用下与DNA有效凝聚。PEI还有一种内在机制，通过所谓的“质子海绵”机制 [1,2]和核定位[6]调节“内体逃逸”，这使其具有高转染效率。在分子量从约1到SOOkDa的 宽范围内，线性或分支状形式的，低分子量PEI已经被证明有良好的耐受性和低毒性[7]。然而，由于在循环过程中的快速清除和RES(网状内皮系统)中的积累，PEI/DNA复 合物形式的PEI在体内没有显示出显著的疗效。这主要归因于复合物整体的正电荷。尽管 复合物的正电荷与细胞膜带负电的成分相互作用促进了复合物的吸收，它们也会与血液成 分发生相互作用和调理作用，使复合物在血液循环中被快速清除。结果是，已有的PEI/DNA 复合物几分钟内就会被从血液循环中清除，主要积累在RES器官中，例如肝和脾[8]。当注 入身体时，这些PEI/DNA复合物在生理环境中还会发生DNA解离和聚合，这些因素限制了已 知的PEI /DNA复合物的体内应用。曾经尝试过几种方法以改进PEI/DNA复合物的体内稳定性[3，5，9]。如在其他纳 米颗粒系统[10]中一样，已经使用聚(乙二醇)(PEG)来提高此类复合物的体内稳定性并 延长其循环时间。为此目的，已经将PEG共价连接到制备好的PEI/DNA复合物上[11]，或使 用连接了 PEG的PEI与DNA形成复合物[12]。制备好的PEI/DNA复合物也可以使用阴离子 肽和PEG的共聚物包被上PEG[13]。在结合PEI和脂质体的技术中，连接了脂质的PEI如软 质酸酯PEI [14]和胆固醇PEI [15]已经被用于制备装载DNA的聚阳离子脂质体(PCL)。也已将制备好的PEI/DNA复合物包封在PEG稳定化的脂质体中，制成所谓的“预浓缩稳定质粒 脂质颗粒”(PSPLP) [16]。然而，很明显还需要其他的方式提高体内基因治疗的成功率。在非病毒基因输送系统中，已经研究了基于聚合物的复合物和基于脂质的系统， 脂质体复合物或包载DNA脂质体，但其在临床应用中显示出局限性。这主要是由于其缺乏 体内稳定性以致不能在治疗水平上输送基因治疗剂到达靶位置。结合了基于聚合物的系统 和基于脂质的系统的三级脂质体复合物也已经被研究。其中，包封了 PEI/DNA复合物的脂 质体纳米颗粒，如bioPSL或pSPLP，已经被计划和测试在体内应用，得到结果是有希望的。 然而，尽管在体内稳定而且达到靶位置的循环时间长，组合系统包括复杂耗时的制备步骤 而且承载能力低。专利技术简述为满足这样的需求，开发了一种装载了核酸，如质粒DNA或SiRNA的新型胶束状纳 米颗粒(MNP)，以及一种构建输送基因的纳米颗粒的新方法。首先将阳离子聚合物，如聚乙 烯亚胺(PEI)，结合到磷脂烷基或酰基链的末端，产生磷脂-聚乙烯亚胺(PLPEI)缀合物。 随后将PLPEI与核酸，如质粒DNA、寡核苷酸(如反义寡核苷酸)、RNA或核酶混合，以形成 大小在纳米尺度上并具有PEI/核酸(PEI/NA)复合物核心和磷脂单层(即单分子层)外膜 结构的复合物。PLPEI的带阳离子的PEI基团和带阴离子的核酸之间的静电相互作用提供 了形成纳米颗粒的驱动力。PLPEI缀合物的磷脂基团在疏水相互作用下排列成单分子层。 将非修饰的(即非缀合的)磷脂如P0PC，胆固醇添加到PLPEI/核酸复合物中以补充环绕 PEI/核酸核心的脂质单分子层。还加入了 PEG-PE以提供纳米颗粒立构稳化。非修饰的脂 质和PEG-PE通过疏水相互作用被纳入单分子层中。最终的结构是空间稳定的胶束样纳米 颗粒，。在优选的实施方案中，本专利技术的纳米颗粒基于磷脂和聚乙烯亚胺(PLPEI)之间的 共价缀合物，PEG-PE以及脂质的组合。磷脂-聚乙烯亚胺缀合物在质粒DNA、非修饰的脂质 和PEG-PE存在的情况下会自组装成由脂质单层包裹硬核的胶束样纳米颗粒，所得到纳米 颗粒的结构、性质适于体内应用。本专利技术的纳米颗粒，一种新的基因输送结构，是无毒，可长期循环的，并且能够在 体内有效的向RES位置和其他器官转染治疗核酸。本专利技术结合了基于聚合物的基因输送系 统和基于脂质的基因输送系统，得到了一种磷脂和聚合物的化学缀合物的新用法。将聚乙 烯亚胺(PEI)缀合在磷脂烷基链的末端0产生了一种新的化学物质，磷脂-聚乙烯亚胺 (PLPEI)缀合物。PLPEI的两个功能区域，i)DNA结合区和ii)膜形成区，分别由PEI和PL 基团形成。在DNA存在的情况下，PLPEI通过聚阳离子PEI和聚阴离子DNA间的静电相互作 用自组装成纳米颗粒。脂质基团间的疏水相互作用也促进了自组装过程。自组装的纳米颗 粒具有独特的结构，其中PEI/NA复合物核心和脂质单层外膜由化学键连接。本专利技术纳米颗 粒不同于脂质体纳米颗粒等，脂质体纳米颗粒中，脂质形成双分子层而非单分子层。本专利技术 纳米颗粒也不同于胶束，胶束完全由疏水相互作用组装而成，并有“临界胶态粒子浓度”的 限制。本专利技术的优点在于提供了简单的、可重复的一步制备方法以及相对于其他包封 PEI/DNA复合物的脂质体纳米颗粒如bioPSL和pSPLP，更高的承载能力。本专利技术的纳米颗 粒还提供了约25% (w/w)的高DNA承载能力，大约是文献已经报道的其他系统值的10倍。此处使用的“DNA承载能力，，或“核酸承载能力，，是指能包含入本专利技术的纳米颗粒的DNA或 其他核酸的量。附图简述本专利技术的其他特征和优点在下文结合附图的优选实施方案以及权利要求中展示。附图说明图1显示PEI/DNA核心为磷脂单层所包围的胶束样纳米颗粒(MNP)自组装过程的 示意图。通过DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纳米颗粒，包含为脂质单层所包裹的核心复合物，所述核心复合物包含与一个或多个阳离子聚合物分子静电结合的一个或多个核酸分子，所述阳离子聚合物与脂质单层内的第一脂质共价缀合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-11-9 61/002,626一种纳米颗粒，包含为脂质单层所包裹的核心复合物，所述核心复合物包含与一个或多个阳离子聚合物分子静电结合的一个或多个核酸分子，所述阳离子聚合物与脂质单层内的第一脂质共价缀合。2.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中的阳离子聚合物包含直链或分支聚乙烯亚胺、 聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚丙烯胺、氨基葡聚糖、或它们的任意组合。3.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中的第一脂质选自由天然的或合成的磷脂、糖脂、 氨基脂、鞘脂、长链脂肪酸和留醇组成的组。4.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中的脂质单层还包含一种或多种非缀合的脂。5.如权利要求4所述的纳米颗粒，所述一种或多种非缀合磷脂分子选自由天然的或合 成的磷脂、糖脂、氨基脂、鞘脂、长链脂肪酸和留醇组成的组。6.如权利要求4所述的纳米颗粒，其中，一部分非缀合磷脂分子是PEG化的。7.如权利要求6所述的纳米颗粒，其中的脂质单层包含PEG-磷脂酰乙醇胺或 pNP-PEG-PE。8.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中的脂质单层还包含胆固醇。9.如权利要求8所述的纳米颗粒，其中脂质单层包含摩尔比率为4 3 3的缀合的 第一脂质、非缀合的脂和胆固醇。10.如权利要求8所述的纳米颗粒，还包含PEG-磷脂酰乙醇胺，其中脂质单层包含摩尔 比为4 3 3 0.3的缀合的第一脂质、非缀合的脂、胆固醇和磷脂酰乙醇胺。11.如权利要求1所述的纳米颗粒，所述一个或多个核酸分子包括寡核苷酸、DNA分子、 RNA分子或它们的任意组合。12.如权利要求11所述的纳米颗粒，所述一个或多个核酸分子包括质粒DNA、RNAi, siRNA、反义寡核苷酸或核酶。13.如权利要求11所述的纳米颗粒，其中的一个或多个核酸分子包括治疗性基因。14.如权利要求13所述的纳米颗粒，其中的治疗性基因是细胞毒性基因或自杀基因。15.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中的一个或多个核酸分子占所述颗粒重量的最 多 40%。16.如权利要求15所述的纳米颗粒，其中的一个或多个核酸分子约占所述颗粒重量的 25%。17.如权利要求1所述的纳米颗粒，其中的阳离子聚合物共价连接到所述第一脂质的 烷基链或酰基链的末端18.如权利要求1所述的纳米颗粒，所述颗粒直径约50nm。19.包含权利要求1所述颗粒的非病毒载体。20.如权利要求19所述的载体，还包含靶向剂。21.如权利要求20所述的载体，其中的靶向剂选自抗体或其抗原结合片段、单链抗体、 域抗体、细胞表面受体的配体、和生物素组成的组。22.如权利要求21所述的载体，其中的靶向剂通过可断裂的键与所述载体相连。23.如权利要求22所述的载体，其中可断裂的键在低pH下断裂。24.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：YT高，A凯勒，VP托奇林，
申请(专利权)人：东北大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]