ＧＡＳ５７突变型抗原和ＧＡＳ５７抗体制造技术

本发明专利技术提供不能切割ＩＬ－８和类似物质但仍保留了诱导抵御酿脓链球菌保护能力的ＧＡＳ５７的突变体。本发明专利技术也提供特异性结合ＧＡＳ５７从而抑制其切割ＩＬ－８和类似物质的抗体。所述突变体等可用于疫苗组合物中诱导抗酿脓链球菌的保护力。所述抗体可用于，例如用作药物治疗酿脓链球菌感染。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术设计免疫学和疫苗学领域。具体说，本专利技术涉及衍生自酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes)的抗原及它们在免疫接种中的应用。
技术介绍
大肠杆菌表达和从其提纯的酿脓链球菌(A群链球菌；GAS)抗原GAS57重组蛋白 在小鼠中诱导了抗酿脓链球菌致死性攻击的保护活性。然而，GAS57是一种蛋白酶，能切割 和灭活人趋化因子如白介素-8 (IL-8) (Edwards 等.，J infectious Diseases. 192,783-90, 2005 ；hidalgo-Grass 等·，EMBO J. 25，4628-37，2006)。GAS57 的这种性能由于可能产生副 作用而妨碍了其在疫苗组合物中的应用。因此，本领域需要不能切割人趋化因子但仍保留 了诱导抵御酿脓链球菌保护能力的GAS57抗原。本领域也需要能特异性结合GAS57抗原从 而削弱GAS57切割IL-8和其它物质能力的抗体。附图简述附图说明图1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显微照片，显示了野生型GAS57可切割IL_8。图2.野生型GAS57 (查询序列SEQ ID NO :1)与C5a肽酶丝氨酸蛋白酶(对象序 列SEQ ID NO 9)的BLAST算法比对。图3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显微照片，显示GAS57点突变体D151A丧失了切割 IL-8的能力。图4.此图所示的ELISA试验结果表明GAS57点突变体D151A丧失了切割IL-8的 能力。图5A-B SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显微照片，显示GAS57单突变体D151A和S617A 及双突变体D151A+S617A丧失了 GAS57的蛋白酶水解活性。图6.此图所示的ELISA试验结果表明单突变体D151A和S617A及GAS57双突变 体D151A+S617A丧失了 GAS57的蛋白酶水解活性。图7. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显微照片，显示野生型GAS57翻译后被修饰成 150. 5kDa和23. 4kDa的两个多肽片段。图8. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显微照片，显示与野生型(黑色箭头)相比，GAS57 突变体D151A、S617A及D151A+S617A翻译后未被修饰成为150. 5kDa和23. 4kDa的两个多 肽片段。对应于未经加工蛋白的一个主要174kDa条带存在于对应于灭活突变株蛋白(灰 色箭头)的泳道中。图9A-B.ELISA试验结果表明，在二种不同实验条件下，抗GAS57多克隆抗血清以 剂量依赖方式抑制GAS57介导的IL-8切割。图9A，培育8小时，0. 1 μ g/ml GAS57。图9B， 培育 24 小时，0. 05μ g/ml GAS57。图10A-GG.不同菌株/M型的GAS57抗原比对。粗黑体字为催化三联体(D、H和 S)。图10A，各图上部为氨基酸1-50 (氨基酸编号，10A-GG为GAS57M1_SF370的氨基酸序列， SEQ ID NO :1)；图 10B，氨基酸 51-100 ；图 10C，氨基酸 101-150 ；图 10D，氨基酸 151-200 ； 图10E，氨基酸201-250 ；图10F，氨基酸251-300 ；图10G，氨基酸301-350 ；图10H，氨基酸351-400 ；图 101，氨基酸 401-450 ；图 10J，氨基酸 451-500 ；图 10K，氨基酸 501-550 ；图 10L, 氨基酸551-600 ；图10M，氨基酸601-650 ；图10N，氨基酸651-700 ；图100，氨基酸701-750 ； 图10P，氨基酸751-800 ；图10Q，氨基酸801-850 ；图10R，氨基酸851-900 ；图10S，氨基酸 901-950 ；图 10T,氨基酸 951-1000 ；图 10U,氨基酸 1001-1050 ；图 10V,氨基酸 1051-1100 ； 图 10W，氨基酸 1101-1150 ；图 10X，氨基酸 1151-1200 ；图 10Y，氨基酸 1201-1250 ；图 10Z, 氨基酸 1251-1300 ；图 10AA，氨基酸 1301-1350 ；图 10BB，氨基酸 1351-1400 ；图 10CC，氨 基酸 1401-1450 ；图 10DD，氨基酸 1451-1500 ；图 10EE，氨基酸 1501-1550 ；图 IOFF 氨基酸 ~ 1551-1600 ；图 10GG，氨基酸 1601-1650。Gas57Ml_SF370, SEQ ID NO 1 ；gas57Ml_31075, SEQ ID NO 10 ；gas57Ml_31237, SEQ ID NO 11 ；gas57Ml_3348, SEQ ID NO 12 ； gas57M2_34585, SEQ ID NO 13 ;gas57M3，1_21398，SEQ ID NO :14 ;gas57M44_61_20839， SEQ ID NO :15 ;gas57M6，31_20022，SEQ ID NO 16 ;gas57Ml 1_20648，SEQ ID NO 17 ； gas57M23_2071, SEQ ID NO 18 ;gas57M18，3_40128，SEQ ID NO 19 ；gas47M4_10092, SEQ ID NO 20 ；gas57M4_30968, SEQ ID NO 21 ；gas57M6，31_22692，SEQ ID NO 22 ；gas57M68, 5_22814，SEQ ID NO 23 ；gas57M68_23623, SEQ ID NO 24 ；gas57M2_10064, SEQ ID NO 25 ；gas57M2_10065, SEQ ID NO 26 ；gas57M77_10251, SEQ ID NO 27 ；gas57M77_10527, SEQ ID NO 28 ；gas57M77_20696, SEQ ID NO 29 ；gas57M89_21915, SEQ ID NO 30 ； gas57M89_23717, SEQ ID NO 31 ；gas57M94_10134, SEQ ID NO 32 ；gas57M28_10164, SEQ ID NO 33 ；gas57M28_10218, SEQ ID NO 34 ；gas57M29_10266, SEQ ID NO 35 ； gas57M28_10299, SEQ ID NO 36 ；gas57M28_30176, SEQ ID NO 37 ；gas57M28_30574, SEQ ID NO :38 ;gas57M6，9_21802，SEQ ID NO 39 ；gas57M75_20671, SEQ ID NO 40 ； gas57M75_30603, SEQ ID NO 41 ；gas57M75_30207, SEQ ID NO 42 ；gas57M22_20641, SEQ ID NO 43 ；gas57M22_23465, SEQ ID NO :44 ;gas57M3，1_30610，SEQ ID NO 45 ；gas57M3, 1_406本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化的突变型ＧＡＳ５７抗原，其在选自氨基酸Ｄ１５１、Ｈ２７９或Ｓ６１７的一个或多个氨基酸位置包含氨基酸改变，其中所述氨基酸的位置按ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１编号，通过ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳或ＥＬＩＳＡ试验检测，该纯化的突变型ＧＡＳ５７抗原对白介素８（ＩＬ－８）的蛋白酶水解活性比野生型ＧＡＳ５７降低至少５０％。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-9-12 60/971,637一种纯化的突变型GAS57抗原，其在选自氨基酸D151、H279或S617的一个或多个氨基酸位置包含氨基酸改变，其中所述氨基酸的位置按SEQ IDNO1编号，通过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳或ELISA试验检测，该纯化的突变型GAS57抗原对白介素8(IL 8)的蛋白酶水解活性比野生型GAS57降低至少50％。2.如权利要求1所述的纯化的突变型GAS57抗原，其特征在于，该抗原包含选自D151A 或S617A的至少一个氨基酸取代。3.如权利要求2所述的纯化的突变型GAS57抗原，其特征在于，该抗原包含SEQID NO 2[D151A]、SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4。4.如权利要求1所述的纯化的突变型GAS57抗原，其特征在于，该抗原是含有第二种 GAS抗原的融合蛋白。5.如权利要求1所述的纯化的突变型GAS57抗原，其特征在于，该抗原偶联于载体蛋白。6.如权利要求5所述的纯化的突变型GAS57抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自细 菌毒素、细菌类毒素、脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白、热激蛋白、百日咳蛋白、流感嗜血杆菌蛋白 D、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B和铁摄取蛋白。7.编码权利要求1所述的纯化的突变型GAS57抗原的核酸分子。8.如权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，该分子编码选自SEQIDNO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的氨基酸序列。9.如权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，该分子包含选自SEQIDNO :6、SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8所示编码序列的核苷酸序列。10.一种特异性结合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割IL-8的能力的抗体制剂。11.如权利要求10所述的抗体制剂，其特征在于，该抗体还抑制野生型GAS57切割人 趋化因子的能力，所述人趋化因子选自CXCLl/GR0a、CXCL2/GR0 β、CXCL3/GR0 γ , CXCL4、 CXCL12/SDF-1a、CXCL12/SDF-1β、CXCL12/SDF-1γ、CXCL5/ENA 78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/ ΝΑΡ-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP10、CXCLl 1、CXCL13、CXCL14 和 CXCL16。12.如权利要求10所述的抗体制剂，其特征在于，该抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、 人源化抗体、嵌合型抗体、F(ab' )2片段、F(ab)自体、Fv分子、非共价异质二聚体、单链Fv 分子(sFv)、二聚抗体片段构建物、三聚抗体片段构建物、微小抗体或它们的混合物。13.—种组合物，其特征在于，该组合物包含(a)选自以下的活性药剂(i)纯化的突变型GAS57抗原，该抗原在选自氨基酸D151、H279或S617的一个或多个 氨基酸位置包含氨基酸突变，所述氨基酸的位置按SEQ ID NO :1编号，通过SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳或ELISA试验检测，该纯化的突变型GAS57抗原对白介素8 (IL-8)的蛋白酶水 解活性比野生型GAS57降低了至少50% ；( )编码所述纯化的突变型GAS57抗原的核酸分子，和(iii)特异性结合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割IL-8能力的抗体制剂；和(b)药学上可接受的运载体。14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，该组合物还包含儿童疫苗所用的活性 药剂。15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述活性药剂选自(a)选自以下的多肽抗原脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、百日咳博德特菌、粘膜炎莫 拉菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病 毒、风疹病毒和轮状病毒多肽抗原；和(b)编码所述多肽抗原的核酸分子。16.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，该组合物还包含用于老年人或免疫力 低下个体疫苗的第二种活性药剂。17...

【专利技术属性】
技术研发人员：I马格里蒂若斯，G格兰迪，C津加瑞蒂，
申请(专利权)人：诺华有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]