人类人工染色体(HAC)载体和包含人类人工染色体(HAC)载体的人类细胞药物制造技术

本发明专利技术涉及携带来源于人染色体的着丝粒、亚端粒序列和端粒序列的人类人工染色体（ＨＡＣ）载体；包含ＨＡＣ载体的人细胞药物或人细胞；制备ＨＡＣ载体和人细胞的方法；以及用ＨＡＣ载体生产治疗性蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了包含来源于人染色体的着丝粒、亚端粒序列和端粒序 列的人类人工染色体(HAC)载体。本专利技术也提供了包含HAC载体的人类 细胞药物或人类细胞。所述人类细胞(药物)可以用于基因治疗和再生 医学。本专利技术也提供了制备包含HAC载体的人细胞、HAC载体，和制 备HAC载体的方法。此外，本专利技术提供了用HAC载体生产治疗性蛋白 的方法。
技术介绍
HAC载体将基因导入哺乳动物细胞中时常用的常规载体，如质粒、粘粒、细 菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或病毒载体具有在附 加体的情况下导入的基因瞬时表达的问题。但是，当基因整合到宿主细 胞的染色体中时，所述常规染色体有一些问题，如宿主染色体基因被破 坏、导入的基因的拷贝数不受调控、导入的基因被灭活，或基因表达受 到宿主染色体(基因整合到其中)的控制序列的影响。作为解决所述问题的手段，由本专利技术人组成的研究小组构建了新的 HAC(21HAC)载体系统，所述构建是使用人21号染色体作为起始材料， 从中除去具有明显结构的不必要的基因，所述起始材料能够容易导入外 源DNA(WO 2004/031385; Katoh et al., Biochem Biophys Res Commun; 321:280-290,2004)。在这些文件中，本专利技术人证明了 21HAC载体能够 在哺乳动物宿主细胞(包括人)中自主复制和分布，21HAC载体稳定保 持，并且可以导入给定拷贝数的基因而不破坏宿主染色体。他们也证明 作为意欲用于离体激素替代基因治疗模型而导入的、其中导入了治疗性 基因，即人红细胞生成素(hEPO)的21HAC载体可以导入培养的正常原 代人成纤维细胞中，EPO表达可以长时间保持，其表达水平可以抑制到 CHO细胞水平的大约1/1,000的水平，导入了 HAC的培养的正常原代人 成纤维细胞可以从单集落扩增到最多3.8 x107个细胞，在非选择性条件下传代培养6-9次后可以保留65.5。/o-90.9。/o的基因(WO 2004/031385; Kakeda et al., Gene Therapy; 12: 852-856, 2005》在离体EPO替代基因治疗的狒狒模型中，据报道，用逆转录病毒载 体导入了 hEPO基因的培养的原代狒狒MSCs (0.81-6.6x 106个细胞 /kg)的胶嚢的皮下移植导致了提高的血液EPO水平和从贫血的恢复 (Bartholomew, A. et al., Hum Gene Ther; 12: 1527-1541, 2001)。但是，对 于基因治疗的目的，需要每个细胞的表达水平的进一步改进。从限制培 养的正常原代人成纤维细胞分裂的观点，细胞分裂事件的数目优选是小 的。为了有效扩增可以在体内表现出效果的、导入了治疗性HACs的细 胞，应该改进和增强载体的稳定性。用于解决前述问题的手段的一个实例是使用高度稳定的人染色体 作为起载体基本骨架作用的人类染色体，构建具有功能性端粒的HAC载体。已知外源基因的表达受到染色质结构或插入位点附近存在或不存 在控制序列的影响。也已知足够长度的功能性端粒是为了稳定保持染色 体所必须的(Smogorzewska, A. et al., Anuu. Rev. Biochem., vol. 73, pp. 177-208， 2004)。尽管存在用绝缘子来消除染色质结构或控制序列对HAC 的影响的实例(Otsuki et al., Biochem Biophys Res Commun; 329: 1018-1025,2005),还没有检查到染色质结构或控制序列的影响的消除， 并且所述绝缘子将不会调节端粒序列。同样，还没有检查到通过端粒序 列调节对HAC载体稳定性的改进，如在HAC上的端粒酶的辅助下，添 加端粒序列或恢复端粒长度。 同源重组效率的改进当导入外源基因时，通常导入药物抗性基因，以选择导入了目的基 因的细胞。在;[艮多情况下，药物抗性基因与相同载体中的靶外源基因平 行放置。当多个基因表达单位平行排列时，已知它们彼此干扰，并且外 源基因的表达水平降低。到目前为止，当构建高水平表达/生产细胞时， 药物抗性基因作为外显子放置，剪切，并且表达以降低药物抗性，并且 选择以高水平表达导入的基因的细胞，以提高表达水平(Barnett, R.S. et al.， Antibody expression and engineering,第3章，p. 27-40, American Chemical Society, 1995)。但是，没有关于从药物抗性基因的消除导致外 源基因的显著改进的表达的报道。已知当在抗体轻链K基因座中敲入外源基因时，除去位于下游的药物抗性基因能够改进小鼠ES细胞中的同源重组效率(JP Patent Publication (kokai) No. 2006-94849 (A)),但其目的不是改进外源基因表达。人染色体和基因表达的稳定性作为涉及小鼠ES细胞的实验的结果，已知导入细胞中的较大染色 体片段导致单个嵌合体中所述细胞的较低贡献比。由本专利技术人组成的研 究小组证明了通过将人14、 2和22号染色体片段，包括抗体基因导入 小鼠胚胎干细胞，可以制备单个嵌合体，在个体中功能性表达导入的抗 体基因，人染色体片段在单个嵌合体中稳定保持，并且所述基因可以通 过种系由下一代遗传(Tomizuka et al., Nature Genet., U.S.A., vol. 16, pp. 133-143, 1997;和Tomizuka et al., P.N.A.S., U.S.A., vol. 97, pp. 722-727, 2000)。检验来源于人14号染色体的天然片段，即SC20(其已经分离， 以制备携带人抗体重链基因的小鼠)和通过将包含抗体轻链基因的人22 号染色体区域克隆到SC20中制备的HAC在小鼠中的稳定性和种系传递 (Kuroiwa et al.， Nature Biotech., U.S.A., vol. 18, pp. 1086-1090, 2000)。此 外，本专利技术人证明了可以在通过体细胞核移植制备的克隆的牛个体中稳 定保持上述来源于SC20的HAC，并且可以在个体中功能性表达导入的 抗体基因(Kuroiwa et al., Nature Biotech., U.S.A., vol. 20, pp. 889-894, 2002)。还没有检查上述来源于人14号染色体的天然片段和HAC在培养 的正常原代人细胞或人细胞系中的稳定性和表达。此外，还没有完全检 查其它来源于人染色体的天然片段和HACs (除了人21号染色体)在培 养的正常原代人细胞或人细胞系中的稳定性和表达。尽管存在报道物的 实例，其中人细胞系保持了来源于人X染色体的微染色体(Mills et al., Hum. Mol. Genet., U.K., vol. 8， pp. 751-761, 1999),但发现这些微染色体 在传代培养后导致显著数目的多拷贝，并且保持给定数目的拷贝仍然是困难的。端粒对表达和稳定性的调节端粒是位于染色体末端的重复序列，其在从酵母细胞到哺乳动物细 胞，包括人的广泛生物物种中是保守的。本文档来自技高网...

【技术保护点】
人类人工染色体（ＨＡＣ）载体，其包含去除了长臂远侧区和／或短臂远侧区的人染色体片段，其中所述人染色体片段包含：　（ｉ）来源于人染色体的着丝粒；　（ｉｉ）端粒序列；　（ｉｉｉ）亚端粒序列；和　（ｉｖ）外源ＤＮＡ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2006-7-7 188392/20061. 人类人工染色体(HAC)载体，其包含去除了长臂远侧区和/或短臂远侧区的人染色体片段，其中所述人染色体片段包含(i)来源于人染色体的着丝粒；(ii)端粒序列；(iii)亚端粒序列；和(iv)外源DNA。2. 权利要求1的HAC载体，其中所述端粒序列和亚端粒序列来源于 哺乳动物染色体的长臂或短臂。3. 权利要求1的HAC载体，其中所述端粒序列和亚端粒序列来源于 人染色体的长臂或短臂。4. 权利要求1的HAC载体，其中所述亚端粒序列来源于人染色体的 长臂。5. 权利要求1的HAC载体，其中所述人染色体片段在从所述人染色 体去除长臂远侧区的位点包含亚端粒序列，所述亚端粒序列来源于与所 述人染色体相同或不同的人染色体的长臂。6. 权利要求1的HAC载体，其中所述端粒序列和亚端粒序列是各自 包含从人14号染色体的14q32区内的位点到14q-tel区的区域的序列。7. 权利要求1的HAC载体，其中所述端粒序列和亚端粒序列是各自 包含从人21号染色体的21q22.3区内的位点到21q-tel区的区域的序列。8. 权利要求1的HAC载体，其中所述亚端粒序列是大约1 - 500 kb。9. 权利要求8的HAC载体，其中所述亚端粒序列是大约5-60 kb。10. 权利要求1的HAC载体，其中所述人染色体片段的大小是大约 19Mb或更小。11 .权利要求1的HAC载体，其中所述外源DNA编码蛋白。12. 权利要求1的HAC载体，其中所述外源DNA插入比从所述人 染色体片段去除长臂远侧区或短臂远侧区的位置更近侧的区域。13. 权利要求1的HAC载体，其中所述外源DNA插入距离端粒序 歹'J l- 500 kb的区域。14. 权利要求1的HAC载体，其中所述人染色体片段是人14号染色 体片段或人21号染色体片段。15. 权利要求1或14的HAC载体，其中所述人染色体片段由于去除而缺乏长臂远侧区，并且包含人染色体的长臂近侧区和短臂。16. 权利要求1或14的HAC载体，其中所述人染色体片段由于去除 而缺乏短臂远侧区，并且包含人染色体的短臂近侧区。17. 权利要求1或14的HAC载体，其中所述人染色体片段由于去除 而缺乏长臂和短臂远侧区，并且包含人染色体的长臂和短臂近侧区。18. 权利要求1或14的HAC载体，其中在人染色体长臂的qll区内 或qll区与q12区之间去除人染色体片段的长臂远侧区。19. 权利要求1或14的HAC载体，其中所述人染色体片段是人14 号染色体片段，并且在人14号染色体的AL391156或比AL391156更近 侧的位置去除人14号染色体片段的长臂远侧区。20. 权利要求1或14的HAC载体，其中所述人染色体片段是人21 号染色体片l殳，并且在人21号染色体的AP001657或比AP001657更近 侧的位置去除人21号染色体片段的长臂远侧区。21. 权利要求1或14的HAC载体，其中在人染色体短臂的pll区内 或pll区与p12区之间去除人染色体片段的短臂远侧区。22. 权利要求1的HAC载体，其中所述人染色体片段进一步包含 (iv)至少一个定点重组酶识别位点。23. 权利要求22的HAC载体，其中所述人染色体片段包含至少两类 定点重组酶识别位点。24. 权利要求22或23的HAC载体，其中所述定点重组酶识别位点 插入人染色体片段的长臂近侧区和/或短臂近侧区。25. 权利要求22或23的HAC载体，其中所述定点重组酶是酶Cre, 并且定点重组酶识别位点是loxP序列。26. 权利要求22或23的HAC载体，其中所述定点重组酶是FLPe 酶，并且定点重组酶识别位点是FRT序列。27. 包含权利要求1 - 26的任一项的HAC载体的细胞。28. 制备人类人工染色体(HAC)载体的方法，包括以下步骤(a) 获得携带人染色体或人染色体片段的细胞；(b) 去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区；(c) 在去除长臂和/或短臂区的位点添加端粒序列；和(d) 在去除长臂和/或短臂区的位点添加亚端粒序列。29. 权利要求28的方法，其中，在步骤(b)中，使用定点重组酶去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区。30. 权利要求28的方法，其中，在步骤(b)和(c)中，通过用端粒序列 取代而去除人染色体或人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区，并且将端 粒序列添加到人染色体或人染色体片段。31. 权利要求28的方法，其中，在步骤(b)和(c)中，切割人染色体或 人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区的至少两个位点，使得去除长臂和 /或短臂远侧区，并且将端粒序列添加到去除长臂和/或短臂的位点。32. 权利要求28的方法，其中，在步骤(b)-(d)中，切割人染色体或 人染色体片段的长臂和/或短臂远侧区的至少两个位点，使得去除长臂和 /或短臂远侧区，并且将来源于人染色体或人染色体片段的端粒序列和亚 端粒序列添加到去除的长臂和/或短臂的位点。33. 权利要求28的方法，其中所述端粒序列和亚端粒序列是各自包 含从人14号染色体的14q32区内的位点到14q-tel区的区域的序列。34. 权利要求28的方法，其中所述端粒序列和亚端粒序列是各自包 含从人21号染色体的21q22.3区内的位点到21q-tel区的区域的序列。35. 权利要求28的方法，其中，在步骤(b)中，在人染色体或人染色 体片段的qll区内或qll区与q12区之间去除人染色体或人染色体片段 的长臂远侧区。36. 权利要求28的方法，其中，在步骤(b)中，人染色体或人染色体 片段是人14号染色体或人14号染色体片段，并且在人14号染色体的 AL391156或比AL391156更近侧的位置去除人14号染色体或人14号染 色体片段的长臂远侧区。37.权利要求28的方法，其中，在步骤(b)-(d)中，人染色体或人染 色体片段是人14号染色体或人14号染色体片段，从人14号染色体或 人1...

【专利技术属性】
技术研发人员：掛田实，富塚一磨，押村光雄，香月康宏，
申请(专利权)人：协和发酵麒麟株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]