用于监控结肠直肠癌的方法技术

本说明书公开的是通过观测选择的ｍｉＲＮＡ序列的调控改变来确定结肠直肠癌的阶段的方法。这些序列可包括ｈｓａ－ｍｉＲ－３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－７、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ以及这些序列的组合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
在一个实施例中，本专利技术涉及通过观测选择的微RNA(miRNA)序列产生的调控改 变来检测和/或监控结肠直肠癌(CRC)的方法。通过观测特定序列的上调或下调改变，可 确定癌细胞的存在以及癌的阶段。
技术介绍
结肠直肠癌(CRC)是世界最常见的癌症之一，并且是发达国家中癌相关死亡的普 遍原因。在一般群体中CRC的总体发病率为5%，并且5-年存活率在40%至60%的范围 内。预后很大程度上依赖于利用癌的形态学和组织病理学的描述性疾病分期体系。然而， 即使在形态学上相似的肿瘤也可在它们的深层次分子改变和致瘤潜能方面不同。CRC从正 常上皮细胞到恶性癌的发展涉及一多步骤过程，基因改变和基因外改变两者的积累，导致 致癌基因短暂激活和抑癌基因的失活，其为包含这些改变的细胞赋予了选择优势。已经进行了许多对蛋白质编码基因的CRC表达谱研究，以更好地解决根本的分子 途径和进一步划分CRC的不同阶段。更近些时候，一类新发现的短的22核苷酸(nt)非编 码RNA (称为微RNA (miRNA))已被鉴定并且与癌引发和发展相关。这些小RNA的生物发生涉 及由RNA聚合酶II进行的转录和由内切核酸酶进行的对初级转录物的加工，生成60-70nt 具有不完全发夹结构的前体miRNA (前miRNA)。前miRNA通过转运蛋白5(eXp0rtin 5)转 运进细胞质中，在细胞质中其经历由RNA酶III Dicer酶进行的加工而产生成熟miRNA，然 后成熟miRNA整合进多蛋白复合体中。已显示这些含有miRNA的复合体通过驻留的miRNA 链与靶序列之间的互补性来与多种mRNA的3'未翻译区(UTR)结合，并基于同源性的程 度，引导翻译抑制或mRNA降解。至此，已有678种鉴定了的人miRNA(miRBase Sequence Database-Release 11)，并且通过计算模型，已暗示可能有多于1000种miRNA基因，包括大 约3%目前已知的人基因组中的基因。此外，生物信息学分析估计，miRNA可调控多至30% 的人蛋白质编码基因，暗示这些小RNA可起到协调复杂信号转导途径之间的相互作用的作 用。数种miRNA已被鉴定为在正常组织和肿瘤组织或癌细胞系之间差异表达。A.和 Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. NatRev Cancer，6 :857_866，2006 ; Bandres，E.，Cube do, E.，Agirre，X.，Malumbres，R.，Zarate，R.，Ramirez, N.，Aba jo，A.， Navarro, A.，Moreno，I. ,Monzo,M.禾口 Garcia-Foncillas，J. Identification byReal-time PCR of 13 mature microRNAs differentially expressed incolorectal cancer andnon-tumoral tissues. Mol Cancer, 5 -.29, 2006 ； Cummins, J. M. , He, Y. , Leary, R.J., Pagliarini, R. , Diaz, L. A. , Jr. , Sjoblom, T. , Bar ad, 0. , Bentwich, Z. , Szafranska, A. E., Labourier, E. , Raymond, C. K. , Roberts, B. S. , Juhl, H. , Kinzler, K. ff. , Vogelstein, B.禾口 Velculescu,V. E. The colorectalmicroRNAome. Proc Natl Acad Sci USA, 103 :3687_3692, 2006 ；Michael, M. Z.，SM, 0. C.，van Hoist Pellekaan, N. G.，Young, G. P.禾口 James， R. J. Reduced accumulation of specific microRNAs incolorectal neoplasia. Mol Cancer Res, 1 :882_891, 2003 ；Lanza, G. , Ferracin, M. , Gafa, R. , Veronese, A. , Spizzo, R. , Pichiorri, F. , Liu, C. G. , Calin, G. A. , Croce, C. M.禾口 Negrini, M. mRNA/microRNAgene expression profile in microsatellite unstable colorectalcancer. Mol Cancer,6: 54,2007)。对于CRC，已进行了有限的研究来检验miRNA的表达模式。显示miRNA的脱调控 (de-regulation)的第一个研究报道了在早至前-腺瘤性息肉阶段的miR-143和miR-145 下调，暗示这些miRNA可能在CRC早期阶段起作用。随后，鉴定了 13种在CRC肿瘤中显示 差异表达的一组miRNA，其中miR-31的表达水平与CRC肿瘤阶段相关。
技术实现思路
在本专利技术的一种形式中，本专利技术包括用于检测细胞样本中结肠直肠癌的存在的方 法。在另一种形式中，本专利技术为诊断细胞样本中的结肠直肠癌的阶段的方法。申请者已发 现了某些miRNA，其在结肠直肠癌中相对于野生型细胞受到差异调控。通过测定这类miRNA 的调控改变程度，可确定组织样本是否包括结肠直肠癌细胞。申请者已发现了某些别的 miRNA，其在晚期(III期和IV期)结肠直肠癌中相对于早期(I期和II期)结肠直肠癌受 到差异调控。通过监测这些miRNA，可将晚期肿瘤样本与早期肿瘤样本相区分而无需依赖于 较不可靠的识别物，例如细胞形态。具体实施例方式^X短语“调控改变”指细胞组分(例如miRNA)相对于野生型细胞中相同细胞组分丰 度的丰度改变。短语“下调”指所考虑的细胞组分丰度的下降，而短语“上调”指组分丰度 增加。根据miRNA差异调控鉴别结肠肓肠细胞当将结肠直肠癌组织与野生型组织比较时鉴定了三十七种差异表达的miRNA(表 1)。从商业来源获得既包括细胞系又包括临床样本的细胞样本。根据常规技术从细胞样本 提取总RNA。例如，可将mirVana分离试剂盒(Ambion)用于速冻样本而将RecoverAll 总 核酸分离试剂盒用于FFPE样本(Ambion)。也可以使用其他常规的RNA提取方法。一旦提 取总RNA后，可通过凝胶电泳分离小的(少于四十个核苷酸的)RNA。对样本进行分析以确 定特定miRNA序列的种类和丰度。可将任何合适的技术用来确定种类和丰度，例如但不限 于RNA印迹分析法。在结肠直肠细胞中鉴别了三十七种表达相对于野生型结肠直肠样本显 著改变的miRNA。表1 在CRC和iH常结肠肓肠组织之间差异表达的miRNA a.标准化的信号强度中值(log2) b.癌正常改变倍数=正常)层次聚类分析显示，上述鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在人中确定结肠直肠癌的阶段的方法，包括如下步骤：观测提取的ＲＮＡ中微ＲＮＡ相对于野生型结肠直肠组织样本中相同微ＲＮＡ的调控改变，其中所述微ＲＮＡ选自ＳＥＱＩＤＮＯ．３８、ＳＥＱＩＤＮＯ．３９、ＳＥＱＩＤＮＯ．２５、ＳＥＱＩＤＮＯ．３３、ＳＥＱＩＤＮＯ．３１以及它们的组合；根据所述观测到的调控改变确定结肠直肠癌的阶段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M拉波尼，GM阿恩德特，
申请(专利权)人：维里德克斯有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]