本发明专利技术提供了一种通过自由流动电泳来分离分析物的有利的
新方法。该方法特别适用于从生物源样品中去除例如白蛋白的主组
分，可选地结合进一步分离样品的剩余部分。由本方法回收的样品
部分能够有利地用于下游的应用如1D或2D-PAGE、HPLC或质谱
分析中。本发明专利技术还提供了缓冲体系、含有该缓冲体系的试剂盒以及
用于实施本发明专利技术的自由流动电泳分离方法的装置。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于连续的、无载体的偏移电泳的方法和装置，其 所涉及的分离条件和介质使得能够分离并可能去除具有不同pi的 某些分析物。
技术介绍
电泳是基于带电粒子在直流电流作用下的迁移而用于分离颗 粒的一种成熟技术。作为上述原理的变型，人们已经开发出了几种不同的才乘作才莫式，例如等电聚焦(IEF)、区带电泳(ZE)和等速电 泳(ITP),它们对于本领i或:技术人员来3兌是7>知的。在电泳才支术中，自由流动电泳(FFE)是最具前景的4支术之一 。 FFE是这样一种技 术，其中分析物的分离发生在无载体介质，即，不存在固定相(或 固体支持材料)的液体(水)介质中，以使由于吸收作用造成的样 品损失降至最^f氐。FFE经常浮皮称为无载体偏转电泳(carrier-less deflection electrophoresis )或无基质偏转电泳(matrix-free deflection electrophoresis )。在蛋白质组学的领域中，FFE是选择用于对复杂的蛋白质样品 根据其不同的等电点(pi)值进行规定的预分离的技术。采用FFE能够对大量不同的分析物，包括有才几和无才几分子、生物并立子、生物13聚合物和生物分子，基于其电泳迁移率而进行分离。相应的原理已经4f到描述。FFE的方法已经得到改进，例如，通过稳定介质和逆流介质的 方式。这反映在例如美国专利5，275，706中，其7>开内容全部结合 于此作为参考。根据该专利，将逆流介质以在电极之间行进的本体 分离介质和样品的连续流动方向相反的方向引入到分离空间中。两 种介质(分离介质和逆流介质)通过分流(fractionation)出口4非出 或洗脱，通常进入孩史量滴定板中，而产生具有低空隙体积(void volume)的分流方法。另夕卜，在分流出口的区域中可维持介质的层 流(即具有非常^f氐的湍流或没有湍流)。一种称为间歇FFE (interval FFE)的特殊FFE技术在例如美国 专利6,328,868中进行描述。在该专利中，将样品和分离介质都引 入电泳室中，采用如ZE、 IEF或ITP的电泳才莫式分离样品中的分析 物，最后通过分流出口从电泳室排出。与本领域中常用的技术(其 中，样品和介质在通过该设备的同时即在电场中被分离(常称为连 续FFE))相反，'868专利的实施方式描述的是，分离介质和样品 移动是单向的，,人电泳室的进口端向出口端4于进，施加的有效电压 导致发生电泳迁移，而样品和介质不会从进口端流体驱动至出口 端。国际专利申请WO 02/50524披露了 一种采用具有分离室的设 备的电泳方法，其中分离介质流动通过分离室，且分离室提供了由 底和盖以及将其二者彼此隔开的间隔而限定的分离空间。另外，该 FFE设备包括用于提供分离介质的泵，分离介质经由介质进料管线 进入分离室，并经由出口离开分离室。该FFE设备还包括用于在分14离介质中施加电场的电极和用于添加颗粒或分析物的混合物的样品注入点以及用于除去分离介质中通过FFE而分离的粒子的分流 点。分离的粒子能够用于分析目的或用于进一步的制备处理。无论 如4可，该申"^青都未7>开4壬4可分离介质的组成。美国专利申i青2004/050698也7>开了 一种自由流动电泳设备， 其包括至少一个分离室，分离介质流动通过分离室。而且，所述FFE 设备包括用于输送分离介质的计量泵(分离介质通过介质进料管线 进入分离室并通过出口离开所述分离室)、用于在分离介质中施加 电场的电极和用于添加待分离颗粒的混合物的样品注入点以及用 于除去分离介质中通过FFE方式分离的粒子的分流点。用于分离诸如生物颗粒和生物聚合物的许多分离介质是本领 i或已知的。例如，K. Hannig和K. H. Heidrich出片反的著作"Free-flow Electrophoresis" (ISBN 3-921956画88-9)中才艮道了适用于FFE并尤其 适用于自由;危动ZE (FF-ZE)的一纟且分离介质。美国专利5,447,612 (授予Bier等)公开了另一种分离介质， 该分离介质是通过在自由溶液中形成功能上稳定的预设(pre-cast) 窄pH区带梯度通过等电聚焦来分离分析物的pH緩沖体系。采用 互^卜纟爰冲对(complementary buffer pairs )中的纟爰沖成分。纟爰冲成分 选自简单的化学上定义的两性电解质，弱酸和弱碱，并基于它们的 解离特性彼此配对从而提供0.4至1.25 pH单位的相当平緩的pH梯 度。IEF(等电聚焦)，是以上的一般电泳操作模式中的一种，包括 自由流动电泳，其是一种常用的技术，例如在蛋白质表征中作为测 定蛋白质等电点的才几制(参见，例长口 ， Analytical Biochemistry, Addison Wesley Longman Limited-Third Edition, 1998)。 区带电泳15(ZE )是基于待分离粒子与所采用的分离介质的带电粒种(charged species )之间的电泳迁移率值差异的另 一种可替代的操作才莫式。IEF涉及^f吏混合物通过包含pH梯度，或可以构成为具有pH梯 度的分离介质。分离室的一侧具有相对较低的pH，而在另一侧具 有相对4交高的pH。在两侧之间，形成逐渐变化(developed)的pH 梯度以控制带电粒子的电泳移动。IEF在各种教科书中都进行了讨 "i仑，例如，P. G. Righetti和J. W. Drysdale所著的《等电聚焦》 (Isoelectric Focusing ) ( North Holland Publ, Amsterdam, and American Elsevier Publ.,纽约，1976 )。蛋白质组学研究将应用于复杂蛋白混合物的高分辨率分离技 术与i见有纟支术的鉴别方法如质"i普(MS)相结合。通常"i人为J见有的 分离和鉴别方法本身均不能给出复杂混合物(例如，诸如血清、血 浆、滑液、脑脊液、尿液、全细胞、细胞碎片或组织提取物等的生 物流体)中的蛋白质组成或蛋白质表达的全面描述。然而，这种局 限性并不妨碍使用现有方法(或几种现有技术的组合)来提供关于 宽范围蛋白质的有价值的信息，尤其是当这些蛋白的存在或者不存 在，或者其表达水平可能与病情相关时更是如此。用于搜索蛋白质 生物标记物的一种策略包4舌在身体的外周液(peripheral fluids)中 直接进行搜索，而外周液中的标记物浓度预计相对较低且现今的检 测方法导致难以实现对其进4于鉴别。在蛋白质生物标记物的发现阶萃殳(discovery phase)中需克月良 的最大障碍是这样的事实，即在方法链如质谱(MS)或凝力交电泳 的结尾处所采用的分析工具对于有限量的蛋白质(或由其衍生的 肽)具有确定的4企测限制(detection limit )。为了全面开拓MS或凝 胶电泳对于肽鉴别的灵敏度限制，有必要富集用作可能的标记物候选物的蛋白质混合物。所以，存在于复杂外周液如血清或血浆中的 丰富蛋白质的浓度就不得不尽可能地降低。血清和血浆都含有可干扰较4氐丰度蛋白质才企测的高水平蛋白 质。从样品中具有不同pl的其他分析物中分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过自由流动电泳从分析物的组合物中分离待分离的分析物的方法，包括： 可选地确定待从分析物的组合物中分离的分析物的ｐＩ； 在自由流动电泳（ＦＦＥ）室中形成阳极和阴极之间的ｐＨ函数分布，包括平均ｐＨ基本对应于待分离分析物的等电点 （ｐＩ）且ｐＨ范围由上限ｐＨ和下限ｐＨ界定的ｐＨ分离平台，并进一步包括在所述阳极和所述ｐＨ分离平台之间的、平均ｐＨ低于所述ｐＨ分离平台的ｐＨ和／或电导率高于所述ｐＨ分离平台的ｐＨ函数，以及在所述阴极和所述ｐＨ分离平台之间的、平均ｐＨ高于所述ｐＨ分离平台的ｐＨ和／或电导率高于所述ｐＨ分离平台的ｐＨ函数； 将含有待从分析物的混合物中分离的分析物的样品引入所述ＦＦＥ室中，其中将所述样品引入所述ｐＨ分离平台、所述ｐＨ分离平台的所述阳极侧区域或所述阴极侧区域中；以及 从所述 ＦＦＥ室洗脱所述分析物，并可选地将全部或部分的所述分析物以一种或多种流分进行回收。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：格哈德·韦伯，
申请(专利权)人：贝克顿迪肯森公司，
类型：发明
国别省市：US
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