蛋白质的提纯方法技术

本发明专利技术提供一种蛋白质的提纯方法，其是从含有目的蛋白质和杂质的混合液中除去所述杂质的蛋白质的提纯方法，所述提纯方法包括使用在微孔表面具有接枝链、且在所述接枝链上固定有阴离子交换基的多孔膜进行过滤的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及。具体地说，本专利技术涉及简便地从含有以动物细胞 培养液为代表的目的蛋白质和杂质的混合液中除去杂质，从而有效地提纯目的蛋白质的方法。
技术介绍
近年，生物技术产业中，蛋白质的实用性大量提纯是一个重要的课题。特别是医药 领域中，抗体药物方面的需要增长得很快，迫切需要确立一种能够有效大量生产和大量提 纯蛋白质的技术。通常，蛋白质是使用来自动物的细胞株经细胞培养生产的。为了将用作目的的蛋 白质(以下有时简称为“目的蛋白质”)、特殊药品的抗体药物实用化，需要从细胞培养液中 除去细胞碎片等浊质成分和来自细胞的溶存的蛋白质等非浊质成分，提纯到足以用于人体 治疗用途的组成。由细胞培养液提纯目的蛋白质的常规操作中，首先，对细胞培养液进行离心分离， 沉降除去浊质成分。接下来，使用精密过滤膜，通过定径过滤(寸^ 7 3過)，将浊质成分中 不能通过离心分离除尽的约Iym以下的细胞碎片除去。进而，为了无菌化，使用最大微孔 径为0. 22 μ m以下的过滤膜，实施无菌化过滤，得到目的蛋白质的澄清溶液(收获工序)。 得到含有目的蛋白质的澄清溶液后，接着采用以亲和色谱法为首的利用2个以上的层析法 技术的组合的提纯工艺来分离提纯目的蛋白质(后处理工序)。由培养液中的细胞产生且 在该培养液中溶存的杂质蛋白质在后处理工序被除去。由细胞培养液提纯目的蛋白质等的 上述现有方法中，该培养液中的目的蛋白质的浓度通常为lg/L以下，该培养液中所含有的 细胞碎片和溶存的杂质蛋白质等的浓度也与目的蛋白质的浓度处于相同的程度。在该浓度 范围，利用现有的收获工序和后处理工序的提纯工艺对目的蛋白质的提纯十分有效。但是，随着抗体药物的需求的急速上升，作为抗体药品的蛋白质面临着大量生产， 随着培养技术的快速进步，近年来细胞培养液中的目的蛋白质的浓度增加，要达到了 IOg/ L。该培养技术的快速进步的同时，意味着细胞培养液中的杂质蛋白质也同样增加了，据预 测，这将对采用现有的蛋白质提纯工艺进行的提纯增加巨大的负荷。因此，作为用于蛋白质的大量提纯的技术，例如专利文献1和2公开了一种蛋白质 吸附膜，其中，在多孔质膜上引入了离于交换基，赋予了多孔质膜蛋白质吸附能力，并也已 经能够购买。另外，作为蛋白质吸附膜的使用例，专利文献3公开了一种方法，其中，使用2种蛋 白质吸附膜(引入了阴离子交换基的纤维素多孔膜和引入了阳离子交换基的纤维素多孔 膜)，从淋巴液分离白蛋白。还有，专利文献4公开了使用引入了阴离子交换基的纤维素多孔膜分离核酸和内 毒素的方法。此外，专利文献5和6分别公 开了在聚醚砜多孔膜引入阳离子交换基和阴离子交换基得到的蛋白质吸附膜。非专利文献1公开了使用含有离子交换基的多孔膜分离核酸和单克隆抗体的方 法。专利文献1 美国专利第5，547，575号说明书专利文献2 美国专利第5，739，316号说明书专利文献3 美国专利第6，001, 974号说明书专利文献4 美国专利第6，235，892号说明书 专利文献5 美国专利第6，783，937号说明书专利文献6 美国专利第6，780，327号说明书非专利文献1 =Bioseparation 8 :281_291，1999
技术实现思路
但是，在将含有高浓度的目的蛋白质的细胞培养液经离心分离、精密过滤、以及无 菌化过滤得到清澄液，并将该清澄液用蛋白A亲和柱(亲和色谱柱)选择性吸附目的蛋白 质后，利用酸性洗脱液洗脱回收时，回收液中常常含有凝聚的杂质。另外，随着蛋白A亲和 柱重复使用的次数增加，该凝聚的杂质的量也增加，同时回收的目的蛋白质的量出现降低 的趋势。如上所述，杂质蛋白质的量越多，亲和层析工序的负荷越大，由于柱的清洗等，提 纯工序所需的时间长，不仅如此，用于亲和层析的色谱柱的珠(beads)的寿命、特别是蛋白 A亲和柱的寿命也变短了。蛋白A亲和柱的价格高，所以不希望该柱的寿命变短。另外，专利文献1 4所公开的方法中，将用于分离的原液预先通过精密过滤膜， 除去颗粒状的不溶物后实施分离操作。这是因为，所使用的蛋白质吸附膜的最大微孔径较 大，为3 μ m 5 μ m，该蛋白质吸附膜不能除去颗粒状的不溶物。专利文献5和6所公开的方法中，蛋白质吸附膜的最大微孔径为0.8μπι 1. 0 μ m，也不能除去微细的颗粒状的不溶物。另外，通常细胞培养液中含有盐，如非专利文献1公开的那样使用离子交换膜的 情况下，来自含有0. IM以上的盐的溶液的蛋白质的吸附量明显减少，所以从细胞培养液除 去杂质蛋白质不能实用。如上所述，由于现有的蛋白质吸附膜的最大微孔径为约0. 8μπι以上，并且在盐的 存在下的吸附量低，没有设想到同时进行目的在于从细胞培养液中除去细胞碎片等微细的 不溶物的除浊、和溶存的杂质蛋白质的吸附，不适合该目的。另外，对于任意的蛋白质吸附膜来说，在溶液中不存在盐的条件下，其动态吸附容 量也不过是单位膜体积为30mg/mL以下，为了有效吸附除去来自细胞培养液的杂质蛋白 质，需要大量的蛋白质吸附膜。而且，这些现有的蛋白质吸附膜是平膜的形态，所以不能紧 凑地收装大量的蛋白质吸附膜。所以，需要收装在大尺寸容器中的大量的蛋白质吸附膜，没 有实用性。另外，在溶液中存在盐的情况下，现有的具有阴离子交换基的蛋白质吸附膜的吸 附量明显降低，所以更不实用。鉴于这些情况，本专利技术要解决的课题是提供一种方法，其中，从以动物细胞培养液 为代表的含有目的蛋白质和杂质的混合液中简便地除去杂质，有效地提纯目的蛋白质。本专利技术人为解决上述课题进行了深入研究，结果意外地发现，使用在微孔表面具 有接枝链、且该接枝链上固定有阴离子交换基的多孔膜时，能有效实现上述目的。S卩，本专利技术提供下述的和中空纤维多孔膜。 一种，其是用于从含有目的蛋白质和杂质的混合液中除去 上述杂质的，其中，所述提纯方法包括使用在微孔表面具有接枝链、且在 上述接枝链上固定有阴离子交换基的多孔膜进行过滤的工序。如上述所述的，其中，上述目的蛋白质是选自由单克隆 抗体、多克隆抗体、人化抗体、人抗体和免疫球蛋白组成的组中的1种。如上述或所述的，其中，上述杂质是选自由非浊质 成分和分散在上述混合液中的浊质成分组成的组中的至少一种。如上述所述的，其中，上述非浊质成分是选自由溶存于 上述混合液中的杂质蛋白质、HCP、DNA、病毒、内毒素、蛋白酶和细菌组成的组中的至少一 种。如上述或所述的，其中，分散在上述混合液中的浊 质成分是选自由细胞和细胞碎片组成的组中的至少一种。如上述 的任一项所述的，其中，上述混合液的盐 浓度为0. OlM 0. 5M。如上述 的任一项所述的，其中，上述混合液的盐 浓度为0. IM 0. 3M。如上述 的任一项所述的，其中，上述多孔膜的 基材是聚乙烯或聚偏二氟乙烯，上述接枝链是甲基丙烯酸缩水甘油酯的聚合物，接枝率为 10% 250%，上述接枝链所具有的环氧基的70%以上被上述阴离子交换基取代。如上述所述的，其中，上述接枝率为10% 150%。如上述所述的，其中，上述接枝率为10% 90%。如上述所述的，其中，上述接枝率为30% 60%。如上述 任一项所述的，其中，上述阴离子交换 基是二乙基氨基和/或三甲基氨基。如上述 任一项所述的，其中，上述阴离子交换基是二乙基氨基。如上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质的提纯方法，其是用于从含有目的蛋白质和杂质的混合液中除去所述杂质的蛋白质的提纯方法，其中，所述提纯方法包括使用在微孔表面具有接枝链、且在所述接枝链上固定有阴离子交换基的多孔膜进行过滤的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：白泷浩伸，篠原直志，
申请(专利权)人：旭化成化学株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]