扩增、检测和定量样品中核酸的方法和组合物技术

本发明专利技术涉及扩增、检测和定量样品中核酸的方法和试剂盒。本发明专利技术方法可用于多种应用中，包括（但不限于）检测和定量来自母体血浆的胎儿核酸、检测和定量来自赘瘤（恶性或非恶性）的循环核酸、精确综合分析低频率等位基因、或任何需要对核酸实施高灵敏度定量分析的其它应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及扩增、检测和/或定量样品中核酸的方法和试剂盒。本专利技术方法可用 于多种应用中，其包括(但不限于)检测和定量来自母体血浆的胎儿核酸、检测和定 量来自赘瘤(恶性或非恶性)的循环核酸、精确综合分析低频率等位基因、或任何需 要对核酸实施高灵敏度定量分析的其它应用。
技术介绍
对核酸实施的扩增、检测和随后的定量分析在分子生物学中具有重要作用，包括 对疾病或病症的诊断和预后。现己知有多种方法可检测核酸，包括基于不同核酸物质 间的序列差异来检测核酸。例如，关于已知方法的综述可参见纳尔逊(Ndson)，临床 试验科学评论(O7Yi ev C"' La&Sd.)， 1998年9月；35(5):369-414。然而，已经证明 很难检测并精确定量核酸，尤其是在其它高拷贝数核酸种类存在下检测并精确定量低 拷贝数核酸。
技术实现思路
核酸检测领域的不足之处在于难以获得能以高灵敏度检测和定量低拷贝数核酸 的检测方法。低拷贝数核酸可在多种应用中提供丰富信息，所述应用包括(但不限于) 非侵害性产前测试、癌症诊断和低频率突变检测。因此，本专利技术提供用于对先前不能 检测、或检测难度极大和/或检测结果极不可靠的低拷贝数核酸进行扩增并随后实施 检测和分析的改良方法，以使其在(例如)临床环境中达到足以提供可靠信息的程度。 在此改良技术的应用中，本专利技术使得可使用灵敏度更高并且侵害性更小的方法来在 (例如)产前测试中检测和定量胎儿核酸。因此在一方面中，本专利技术涉及优选地基于低拷贝数核酸物质序列特异性来对所述 核酸物质实施偏倚性等位基因特异性(BAS)扩增的方法和试剂盒，其中以比高拷贝数 物质特异性引物高的浓度引入低拷贝数物质特异性引物，以将所述物质选择性扩增至 适于精确检测和定量的程度。因此，本专利技术提供相对于高拷贝数核酸物质优先扩增低 拷贝数核酸物质并定量两种物质相对含量的方法。在某些实施例中，可同时添加两种 或更多种引物，或在其它实施例中可于不同时间添加(例如添加第一引物后添加第二 引物或添加第二引物后添加第一引物)。在某些实施例中也可将各种引物添加至同一 容器中，或在某些实施例中可将其添加至不同容器中。更具体来说，本专利技术一方面提供扩增样品中核酸的方法，所述样品至少含有第一 和第二核酸物质，其中所述第一物质具有比所述第二物质高的拷贝数，所述方法包含 以下步骤a)在反应容器中使实质上对第一核酸物质具有特异性的第一扩增引物退 火到第一核酸物质上，其中所述第一引物对具有第一浓度；b)在反应容器中使实质 上对第二核酸物质具有特异性的第二扩增引物退火到第二核酸物质上，其中所述第二 引物具有第二浓度并且其中第二扩增引物的所述第二浓度大于第一扩增引物的所述第一浓度；C)在反应容器中使第一和第二核酸物质通用的且实质上对第一和第二核 酸物质具有特异性的另一扩增引物退火到第一和第二核酸物质上；以及d)在反应容 器中实施核酸扩增反应，藉此所述第二核酸物质扩增产物的量相对于所述第一核酸物 质扩增产物的量有所增加。步骤(c)中的"另一扩增引物"可为一或多种引物。例如， 在涉及使用一种额外引物的实施例中，所述引物可与第一核酸和第二核酸二者通用的 核苷酸序列特异性杂交。例如，在涉及使用两种额外引物的实施例中， 一种额外引物 可特异性地与第一核酸杂交，并且第二种额外引物可特异性地与第二核酸杂交。在本专利技术实施例中，扩增方法可包括(但不只包括)聚合酶链反应、自动维持序 列反应、连接酶链反应、cDNA末端快速扩增、聚合酶链反应和连接酶链反应、Q-P噬菌体扩增、链置换扩增、或剪接重叠延伸聚合酶链反应。在优选实施例中，扩增 方法为PCR。在本专利技术另一实施例中，扩增方法采用美国专利申请公开案第 20050287592号中所述模板依赖性聚合酶，所述专利是以引用方式并入本文中。在另一实施例中，本专利技术提供本文所述扩增方法，其另外包含单独检测第一核酸 物质的扩增产物、单独检测第二物质、或同时一起检测第一和第二物质的步骤。在另 一实施例中，本专利技术提供本文所述扩增方法，其另外包含以下步骤a)检测所述第 一核酸物质的扩增产物；和b)检测所述第二核酸物质的扩增产物；和C)比较所述第一核酸物质的身份与所述第二核酸物质的身份。在相关实施例中，通过质谱法来实施 检测。在另一实施例中，本专利技术提供本文所述扩增方法，其另外包含以下步骤a)定 量所述第一核酸物质的扩增产物；和b)定量所述第二核酸物质的扩增产物；和c)比较所述第一核酸物质扩增产物的量与所述第二核酸物质扩增产物的量。在相关实施例 中，通过质谱法来实施定量。在优选实施例中，第一核酸物质来源于母体而第二核酸物质来源于胎儿。在另一方面中，提供在至少含有第一和第二物质的样品中鉴定低拷贝数核酸物质 的方法，其中在两个单独反应容器中扩增所述物质。更具体而言，本专利技术提供扩增样 品中核酸的方法，样品至少含有第一和第二核酸物质，其中一种所述物质具有比另一 种所述物质高的拷贝数，所述方法包含以下步骤a)在第一反应容器中，使实质上 对所述第一核酸物质具有特异性的第一扩增引物退火到所述第一核酸物质上，其中第 一引物具有第一浓度；b)在所述第一反应容器中使实质上对所述第二核酸物质具有特异性的第二扩增引物退火到所述第二核酸物质上，其中第二引物具有第二浓度并且其中第二扩增引物的所述第二浓度大于第一扩增引物的所述第一浓度；C)在所述第一反应容器中使第一和第二核酸物质通用的且实质上对第一和第二核酸物质具有特 异性的另一扩增引物退火到所述第一和第二核酸物质上，并实施核酸扩增反应，藉此 在所述第一物质具有较高拷贝数时使所述第二核酸物质扩增产物相对于所述第一核酸物质扩增产物有所增加；d)在第二反应容器中使第一扩增引物退火到所述第一核 酸物质上，其中所述第一扩增引物所存在浓度与步骤b中的所述第二浓度相同；e)在 所述第二反应容器中使第二扩增引物退火到所述第二核酸物质上，其中所述第二扩增 引物所存在浓度与步骤a中所述的第一浓度相同，由此所述第一扩增引物的浓度大于 所述第二扩增引物的浓度；和f)在所述第二反应容器中使所述第一和第二核酸物质 通用的另一扩增引物退火到所述第一和第二核酸物质上，并实施核酸扩增反应，藉此 在第二物质具有较高拷贝数时使所述第一核酸物质扩增产物相对于所述第二核酸物 质扩增产物有所增加。在本专利技术实施例中，二容器扩增方法另外包含检测所述第一核酸物质扩增产物的 步骤。在另一实施例中，所述方法另外包含检测所述第二核酸物质扩增产物的步骤。在另一实施例中，所述方法另外包含以下步骤同时检测所述第一核酸物质和所述第二核酸物质，并比较所述第一与第二核酸物质的身份。在另一实施例中，方法另外包 含定量所述第一核酸物质的扩增产物，定量所述第二核酸物质的扩增产物，并比较所 述第一核酸物质扩增产物的量与所述第二核酸物质扩增产物的量。在另一方面中，本专利技术提供确定高拷贝数引物与低拷贝数引物的适宜或最佳比率 的方法。参见以下实例1。在相关实施例中，本专利技术提供确定足以优先扩增实例1中所述低拷贝数核酸物质的第一PCR引物浓度的方法。基于不同物质间的核酸基差异(或等位基因)，本发 明方法可用于优先扩增不同核酸物质并由此实施检测和定量。在某些实施例中，本发 明可用于检测突变和染色体异常，包括(但本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增样品中核酸的方法，所述样品至少含有第一和第二核酸物质，其中所述第一物质具有比所述第二物质高的拷贝数，所述方法包含以下步骤：　ａ）在反应容器中使实质上对所述第一核酸物质具有特异性的第一扩增引物退火到所述第一核酸物质上，其中所述第 一引物具有第一浓度；和　ｂ）在所述反应容器中使实质上对所述第二核酸物质具有特异性的第二扩增引物退火到所述第二核酸物质上，其中所述第二引物具有第二浓度并且其中所述第二扩增引物的所述第二浓度大于所述第一扩增引物的所述第一浓度；和　ｃ ）在所述反应容器中使所述第一和第二核酸物质通用的且实质上对所述第一和第二核酸物质具有特异性的另一扩增引物退火到所述第一和所述第二核酸物质上；和　ｄ）在所述反应容器中实施核酸扩增反应，藉此使所述第二核酸物质扩增产物的量相对于所述第一核酸 物质扩增产物的量有所增加。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：李闵榭，
申请(专利权)人：塞昆纳姆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]