筛选改变皮肤和/或头发色素沉着的化合物的方法技术

本发明专利技术提供了鉴定化合物的方法，所述化合物提高或降低皮肤和／或毛发色素沉着，所述方法包括测定测试化合物调节ＮＣＫＸ介导的钙离子跨膜运动的能力（例如，ＮＣＫＸ５）。所述方法包括使包含ＮＣＫＸ分子或其变体、融合体或衍生物的膜暴露于测试化合物，并直接或间接地测量所述膜的一侧或两侧的钙离子浓度的步骤。本发明专利技术还涉及在本发明专利技术的方法中有用的试剂盒、核酸分子、多肽和细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及鉴定在改变皮肤色素沉着方面具有活性的化合物的方法，以及在所述方法中有用的核酸分子、多肽和细胞。皮肤是身体中最大的器官，在温度调节、保护免于物理和化学的伤害、保护免于感染以及维生素D的产生方面具有作用。存在着多种的皮肤颜色，其可能与气候、大陆和文化相关。深色皮肤主要位于更靠近赤道的较热的气候中，被认为提供了针对UV辐射和热量的保护。浅色的皮肤在较冷的区域中存在，在该区域UV保护的需要较少，并且还与提高的维生素D产生相关。对于皮肤颜色负责的主要色素是胡萝卜素、血红蛋白以及特别是黑色素。黑色素由两种主要亚型组成，较深色的真黑色素和较浅色的褐黑色素。黑色素由黑素细胞合成，与其他蛋白质组合成微粒，其然后再分配到角质形成细胞中。黑色素的数量受到UV辐射暴露的影响，因而通过提高皮肤中黑色素的数量产生了更深色的皮肤。组成型和诱导型皮肤和毛发色素沉着的遗传学基础还没有完全了解，假说是多种基因涉及色素沉着。在外界因素，例如阳光影响皮肤颜色之前，这些基因的不同变体影响了个体的皮肤颜色表型。专利技术概述在本专利技术的第一个方面，提供了鉴定化合物的方法，所述化合物提高或降低皮肤和/或毛发色素沉着、或改变皮肤和/或毛发的黑色素组成(composition)，所述方法包括测定测试化合物调节NCKX介导的钙离子跨膜运动的能力。NCKX分子可以来自任何物种，特别是哺乳动物，最优选的是人类。NCKX分子的实例是NCKX1(基因登记号no.NM_004727，蛋白质登记号no.-NP_004718)；NCKX2基因登记号no.NM_020344，蛋白质登记号no.NP_065077)；NCKX3(基因登记号no.NM_020689，蛋白质登记号no.NP_065740)；NCKX4(基因登记号nos.NM_153648、NM_153646、NM_153647；蛋白质登记号nos.NP_705934、NP_705932、NP_705933)；NCKX5(序列参见附图1，基因登记号nos.NM_205850-->XM_208771，蛋白质登记号nos.NP_995322 XP_208771)以及NCKX6(基因登记号no.NM_024959，蛋白质登记号no.NP_079235)(参见Cai&Lytton(2004)Mol Biol&Evolution vol 21 no9 pgl692-1703以及Schnetkamp(2004)Pflugers Arch-Eur J Physiol vol 447pg 683-688)优选地，NCKX分子是NCKX5。NCKX5也被称为SLC24A5。优选地，所述方法包括使包含NCKX分子或其变体、融合体或衍生物的膜暴露于测试化合物，并直接或间接地测量所述膜的一侧或两侧的钙离子浓度的步骤。本专利技术的方法可以包括以下步骤：(a)提供包含至少一种NCKX分子或其功能等效的变体、融合体或衍生物的膜，其中所述膜分割了两个不同的区室；(b)在暴露于一种或多种测试化合物之前测量一个或两个区室中的钙离子(Ca2+)浓度；(c)所述膜暴露于一种或多种测试化合物；(d)暴露于一种或多种测试化合物之后测量一个或两个区室中的钙离子(Ca2+)浓度；(e)通过比较步骤(b)和步骤(d)中测量的浓度来鉴定钙离子(Ca2+)跨膜运动的数量；本专利技术的方法还可以进一步包括与对照值比较响应于测试化合物的钙运动。这种比较可以使用以下步骤实现：(f)重复上述步骤(a)、(b)、(d)和(e)来提供没有暴露于一种或多种测试化合物时钙离子(Ca2+)浓度改变的对照结果；(g)比较在暴露于所述测试化合物之后在步骤(e)中鉴定的钙离子(Ca2+)跨膜运动的数量、在步骤(f)的对照中钙离子(Ca2+)跨膜运动的数量(h)鉴定钙离子(Ca2+)跨膜运动的数量是否响应于对所述测试化合物的暴露而提高、降低或保持相同。可选择的对照方法将是比较钙离子跨越不含NCKX蛋白质的对照膜的运动的数量。NCKX5(也称为SLC24A5)是钠、钙/钾交换器家族(NCKX)-->的成员，以及发现影响斑马鱼中的色素沉着。在斑马鱼中，NCKX5中的突变展现了与“金色”突变相关的色素沉着的降低(Lamason(2005)Science 310 ppl782-1786)。已经进行了其他钠-钙交换器的研究，显示了例如NCKX1和NCKX2展现在人类光受体、牛心肌中的钙交换功能(Winkfein(2003)Biochemistry 42 pp543-552 and Schnetkamp(1996)Biochem.Cell.Biol.74 pp535-539)以及动脉平滑肌Epublication：Doug(2006)AmericanJournal Physiol.Heart Circ.Physiol(April 14th 200 6)doi：10.1152/ajpheart.00196.2006。申请人现在已证明了NCKX5与黑素细胞中的钠-钾/钙交换功能相关，并且该功能与皮肤色素沉着紧密地相关。此外，申请人证明了由于单核苷酸多态性(SNP)，NCKX5以氨基酸111处的两种等位形式存在。Ala111版本(version)与提高的钙运动相关，主要在深色皮肤中存在。Thr111版本与降低的钙运动紧密相关，主要在较浅色的皮肤中存在(参见实施例1和2)。包括SNP的位置的NCKX5序列在附图1中示出。优选地，钙离子(Ca2+)跨膜运动的数量的提高表明测试化合物提高皮肤色素沉着，钙离子(Ca2+)跨膜运动的数量的降低表明测试化合物降低皮肤色素沉着。任选地，本专利技术的方法进一步包括以下步骤：(i)分离一种或多种测试化合物。进一步任选地，所述方法包括以下步骤：(j)将步骤(i)中分离的所述一种或多种测试化合物配制到化妆品或药物制剂中。方便地，所述膜是生物膜，例如，优选地作为完整细胞的部分的细胞膜。细胞膜和/或完整细胞的优选的来源是仓鼠胚肾(HEK)细胞、击掌(High five)昆虫细胞、酵母细胞、盘基网柄菌(dictyostelium)细胞、烟草植物细胞、p53缺陷细胞系H1299和/或细菌。有益地，所述NCKX5分子天然地位于所述膜中，或者人工地靶向所述膜，或重构到人工的膜中。-->优选地，当所述NCKX5人工地靶向所述膜时，通过连接使多肽...

【技术保护点】
一种鉴定化合物的方法，所述化合物提高或降低皮肤和／或毛发色素沉着、或改变皮肤和／或毛发的黑色素组成，所述方法包括测定测试化合物调节ＮＣＫＸ介导的钙离子跨膜运动的能力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2006-5-31 06114771.61.一种鉴定化合物的方法，所述化合物提高或降低皮肤和/或毛发
色素沉着、或改变皮肤和/或毛发的黑色素组成，所述方法包括测定测
试化合物调节NCKX介导的钙离子跨膜运动的能力。
2.权利要求1的方法，包括使包含NCKX分子或其变体、融合体或
衍生物的膜暴露于测试化合物，并直接或间接地测量所述膜的一侧或
两侧的钙离子浓度的步骤。
3.权利要求1或2的方法，包括以下步骤：
(a)提供包含至少一种NCKX分子或其功能等效的变体、融合体或
衍生物的膜，其中所述膜分割了两个不同的区室；
(b)在暴露于一种或多种测试化合物之前测量两个区室中的钙离
子(Ca2+)浓度；
(c)使所述膜暴露于一种或多种测试化合物；
(d)在暴露于一种或多种测试化合物之后测量两个区室中的钙离
子(Ca2+)浓度；
(e)通过比较步骤(b)和步骤(d)中测量的浓度来鉴定钙离子(Ca2+)
跨膜运动的数量；
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述NCKX分子是NCKX5。
5.权利要求3或4的方法，进一步包括与对照测量比较响应于测试
化合物的钙离子运动的步骤。
6.权利要求3、4或5中的方法，进一步包括以下步骤：
(f)重复上述步骤(a)、(b)、(d)和(e)来提供没有暴露于
一种或多种测试化合物时钙离子(Ca2+)浓度改变的对照结果；
(g)比较在暴露于所述测试化合物之后在步骤(e)中鉴定的钙离
子(Ca2+)跨膜运动的数量、在步骤(f)的对照中钙离子(Ca2+)跨
膜运动的数量；
(h)鉴定钙离子(Ca2+)跨膜运动的数量是否响应于对所述测试化
合物的暴露而提高、降低或保持相同。
7.权利要求3、4或5的方法，进一步包括比较跨越不含NCKX蛋白
的对照膜的钙离子运动数量的步骤。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中钙离子(Ca2+)跨膜运动
的数量的提高表明所述测试化合物提高皮肤和/或毛发色素沉着，钙离
子(Ca2+)跨膜运动的数量的降低表明所述测试化合物降低皮肤和/或
毛发色素沉着。
9.前述权利要求中任一项的方法，进一步包括以下步骤：
(i)分离所述一种或多种测试化合物。
10.权利要求9的方法，进一步包括以下步骤：
(j)将步骤(i)中分离的所述一种或多种测试化合物配制到化妆品
或药物制剂中。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述膜是生物膜。
12.权利要求11的方法，其中所述生物膜是细胞膜。
13.权利要求12的方法，其中所述细胞膜是完整细胞的部分。
14.权利要求12或13的方法，其中所述细胞膜和/或完整细胞选自
仓鼠胚肾(HEK)细胞、击掌昆虫细胞、酵母细胞、盘基网柄菌细胞、
烟草植物细胞、p53缺陷细胞系H1299和/或细菌。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述NCKX分子天然地位
于所述膜中、人工地靶向所述膜、或重构在人工的膜中。
16.权利要求15的方法，其中通过连接将多肽靶向或包括在膜中的
前导序列和/或标记来将所述NCKX人工地靶向所述膜。
17.权利要求16的方法，其中所述前导序列来自NCKX2或4、酵母
α配偶因子、NCX蛋白、TGFbeta、血细胞凝集素或病毒表面蛋白。
18.权利要求17的方法，其中所述前导序列是hsNCKX2的N末端序
列(氨基酸1到120)。
19.前述权利要求中任一项的方法，其中所述钙离子(Ca2+)浓度
和/或运动利用选自Ca2+敏感性染料(荧光和/或非荧光的)、膜片钳或
放射性钙的方法来测量。
20.前述权利要求中任一项的方法，其中所述NCKX分子或其功能
等效的变体、融合体或衍生物具有在氨基酸残基111的等效密...

【专利技术属性】
技术研发人员：W费尔塞尔，RS金格尔，MR格林，CD贾曼，RM奥博恩，PPM施内特坎普，S威尔逊，
申请(专利权)人：荷兰联合利华有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[]