拷贝数变化确定、方法和系统技术方案

本发明专利技术的用于确定受试者基因组中靶多核苷酸拷贝数变化的方法和系统包括基于扩增的技术。所述方法可以包括预扩增样品，及随后分配样品和许多反应体积，定量检测靶多核苷酸和参考多核苷酸，和分析以确定受试者基因组中靶多核苷酸序列的相对拷贝数。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于确定来自小群体或个体基因组内拷贝数变化的方法并发现在生物学和医学中的应用。
技术介绍
“数字PCR”指这样的方法，其中在PCR扩增一种以上靶序列之前，将样品中存在的 单个核酸分子分配到许多单独的反应体积(例如，室或等分试样)中。调节样品中单个分子 的浓度，以使得在分配后，每个反应体积包含少于一个离散的多核苷酸分子(或连接的多 核苷酸分子的集合)，且大部分室包含0或一个分子。靶序列的扩增导致二进制数字输出， 其中每个室被确定为包含或不包含表示相应靶序列存在的PCR产物。包含可检测的PCR终 产物水平的反应体积的计数是绝对核酸量的直接测量。在一种数字PCR版本中，多核苷酸 分子通过分隔它们而被分配到单独的反应体积中。一种分隔方法使用BioMark 12. 765数 字阵列(Fluidigm Corp.，South San Franscisco，CA)。该芯片利用将样品混合物和试剂 分隔到765个纳升体积反应室中的集成电路通道和电子管。将每个混合物中的DNA分子随 机分隔到每组的765个室中。然后热循环该芯片，并在Fluidigm' sBioMark实时PCR系统 上成像，且最初包含1个以上分子的阳性室可以通过数字阵列分析软件来计数。关于数字 PCR 的讨论，参见，例如，Vogelstein 和 Kinzler，1999，Proc Natl Acad Sci USA (美国国 家科学院学报)96 9236-41 ；McBride等，美国专利申请公开号20050252773，特别是实施例 5 ；拷贝数变化(CNVs)是基因组区域的获得或缺失，其尺寸在500个碱基以上的 范围内(通常在5千和5百万碱基之间)。全基因组研究已经揭示了大量CNV区域在 人中的存在和遗传多样性在一般人群中广阔范围。CNV由于其在人遗传病症中的作用， 一直是许多近期研究的焦点。参见，例如Iafrate等，2004，Detection of large-scale variation in the human genome (检测人基因组中的大规模变化)· Nat Genet(自然遗 传学)36 949-951 ；Sebat 等，2004，Large-scale copy number polymorphism in the human genome (人基因组中的大规模拷贝数多形性).Science (科学)305 :525_528 ；Redon 等，2006, Global variation in copy number in the human genome (人基因组中拷贝 数的综合变化)· Nature (自然)444 :444_454 ;Wong 等，2007，Acomprehensive analysis of common copy-number variations in the humangenome (人基因组中常见拷贝数变 化的综合分析).Am J Hum Genet (美国人类遗传学杂志)80 :91_104 ;Ropers，2007，New perspectives for theelucidation of genetic disorders (阐明遗传病症的新观点)· Am JHum Genet()81 199-207 ；Lupski，2007， Genomicrearrangements and sporadic disease (基因组重排和偶发性疾病).Nat Genet (自然遗传学)39 S43-S47，通过参考将其每篇引入。非整倍性，诸如三体性或全染色体缺失，是与许多人类疾 病有关的局限型拷贝数变化。专利技术简述本专利技术涉及用于确定来自小群体或个体的基因组中拷贝数变化的方法。所述方法 在通过数字PCR分析之前，提供目的基因在样品中的预扩增。预扩增步骤容许将基因的各 个拷贝的分布分配到各个PCR反应样品中，从而以这样的方式检测，所述方式是比在无预 扩增条件下由数字PCR确定时更能代表实际的拷贝数。本专利技术的基于数字PCR的方法具有以非常高的精确性辨别基因拷贝数小于2倍的 差别的能力。例如，它可以在不同样品中的1，2，3和4个基因拷贝之间作出区分。为了确 保不同样品中基因拷贝数的表观差异是真实的，且不受由样品量的差异而失真，我们使用 称为相对拷贝数的术语。基因的相对拷贝数(/人基因组)可以表述为靶基因拷贝数与DNA 样品中单拷贝参考基因的拷贝数的比，通常是1。例如，RNA酶P基因是编码RNA酶P的RNA 结构部分的单拷贝基因，且可以用作拷贝数测定中的参考基因。可商购的用于进行数字PCR的数字阵列芯片，诸如图3中举例说明的，已经用于量 化样品中的DNA。所述芯片具有12个用于引入样品混合物的样品输入端口。将每个样品混 合物分隔到12个组的每一个组的765个反应室中。如文献(参见，例如，McBride等，美国 专利申请公开号20050252773)中所述，量化样品中DNA的能力基于这样的事实，即当引入 适当量的DNA时，单DNA分子随机分配到所述室中。通过利用在一个芯片上使用两种荧光染料的两种基因(例如RNA酶P和另一种目 的基因)的两种测定，可能同时量化同一 DNA样品中的RNA酶P和另一种基因并获得这两 种基因比例和目的基因拷贝数的良好评估。然而，当复制时，一种基因的多拷贝可以紧密连接在相同染色体上并因此不能彼 此分隔开，即使在数字阵列上。结果，多拷贝应该表现为一个分子，并且会非常低估基因拷 贝总数。本专利技术通过在该过程中包括预扩增步骤解决这个问题。预扩增是使用目的基因 和参考基因(例如，RNA酶P基因)的引物的PCR反应。其典型地进行有限次数的热循环 (例如10次循环)；假定相等的PCR效率，这两种基因的拷贝数在预扩增步骤中按比例增 力口。利用该过程，即使基因多拷贝在基因组上连接在一起，但是，预扩增后，目的基因的每个 拷贝应该分别扩增，且应该分别分隔到数字阵列的不同室中。由于两种基因新产生的分子 反映最初的比例且它们不再连接，所以数字芯片分析可以精确量化这两种基因的分子和测 量这两种基因的比例(因此，目的基因的拷贝数)。因此，本专利技术提供用于进行基于基因的分析的系统和相关方法。更具体地，本专利技术 的方法和系统通常涉及确定来自受试者的样品中目的多核苷酸的拷贝数变化。在一个方面，本专利技术提供用于确定受试者基因组中靶多核苷酸序列的相对拷贝数 的方法，包括以下步骤a)预扩增包含受试者基因组DNA的样品中的靶基因序列和参考基因序列；由此生 成扩展的样品；b)通过将(a)的产物分配到许多独立的反应体积中进行数字PCR，在各个反应体 积中扩增靶基因序列和参考基因序列，和确定扩增样品中靶基因序列和参考基因序列的相对量，其中扩增样品中靶基因序列和参考基因序列的相对量对应于基因组中靶基因序列和 参考基因序列的相对量。在相关的方面中，本专利技术提供用于确定受试者基因组中靶多核苷酸序列相对拷贝 数的方法，包括以下步骤预扩增包含受试者基因组DNA的样品中的靶基因序列和参考基因序列；通过数字PCR测定预扩增样品的靶基因序列和参考基因序列；确定(a)包含靶基因序列的扩增的多核苷酸分子数和(b)包含参考基因序本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于确定受试者基因组中靶多核苷酸序列的相对拷贝数的方法，包括：预扩增包含所述受试者基因组ＤＮＡ的样品中的靶基因序列和参考基因序列；通过数字ＰＣＲ测定预扩增样品的靶基因序列和参考基因序列；确定（ａ）包含所述靶基因序列的扩增多核苷酸分子数和（ｂ）包含所述参考基因序列的扩增多核苷酸分子数并确定（ａ）与（ｂ）的比。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉姆什瑞马克瑞莎娜，
申请(专利权)人：弗卢丁公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]