利用鱼类血细胞监测海水中苯并ａ芘的方法。取５０μＬ经缓冲液在冰上处理好的金黄色葡萄球菌悬液与暴露于含有苯并ａ芘海水中的牙鲆红细胞悬液等体积混合，细胞数的比为２０∶１，２０℃恒温孵育３０ｍｉｎ。其间每隔１０ｍｉｎ摇动混匀，防止沉淀。孵育完成后终止反应。每管加入２０μＬ预冷的０．２５％的戊二醛溶液，４℃冰箱中固定１５ｍｉｎ。取孵育液涂片，晾干后甲醇固定。每张涂片经Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ染液染色３ｍｉｎ，用蒸馏水冲洗至无色为止。晾干后油镜下观察计算红细胞Ｃ３ｂ受体花环率。将每个红细胞粘附两个及两个以上金黄色葡萄球菌为一个花环。检测方法在１ｈ内完成，可以较好的监测分析海水是否受到苯并ａ芘的污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于本专利技术涉及基于鱼类血细胞免疫粘附活性变化的海水有毒有机污染 物的检测方法。
技术介绍
近年来，随着科学技术的进步和工农业生产的发展，越来越多人工合成的有毒有 机污染物(包括石油烃、多氯联苯、有机氯农药、多环芳烃、三丁基锡等)在近岸海水、沉积 物和海洋生物体内普遍检出，有机污染问题日渐突出，已成为世界各国科学界和政府关注 的新热点。研究表明，有毒有机污染物毒性大，容易溶解在生物有机相中，在海洋生物体内 高度富集，破坏海洋生物的遗传物质，影响海洋生物的繁殖能力，改变受污染水域的海洋生 物的种群组成，导致海洋生态系统失调，而且可通过鱼类、贝类及其它海产品进入人体，危 及人类健康。因此，国内外研究学者越发关注海洋中有毒有机化合物的污染监测及其潜在 危害。对于海洋中有毒有机化合物的监测，主要有化学监测和生物监测两种方法，其中 化学监测法主要通过液-液萃取方法，富集海水中有毒有机化合物，通过测定萃取液中有 机化合物的量来反映它们对海洋环境的污染程度，包括荧光分光光度法\紫外分光光度 法、气相色谱-质谱联用(GC-MQ联用技术等2。生物监测方法主要是利用海洋底栖生物贻 贝、蛤、蚝等滤食性贝类体内有机污染物的残留水平来反映背景水体中各种有毒有机污染 物质含量3。但在实际海洋有毒有机污染物监测过程，化学监测方法相对繁琐，并且检测灵 敏度越高所需仪器价格就越贵，因此在地方基层海洋环境监测单位不容易推广。生物监测 方法则主要以底栖贝类作为指示物种，并不能真实反映表层海水中的有机污染情况。因此 以鱼类作为有毒有机污染物的指示物种，建立一种相对灵敏而便捷的检测分析方法，对于 丰富海水中有毒有机污染物检测方法、完善海水水质检测标准具有重要意义。参考文献1.韦蔓新，何本茂.钦州湾近20a来水环境指标变化趋势II油类的分布特征及其 污染状况.海洋环境科学，2003，22 O) :49-52.2.江桂斌，徐福正，何滨等.有机锡化合物测定方法研究进展.海洋环境化学， 1999,18(3) :61-68.3.刘仁沿，吴世培，王斌.长江口以北沿海主要经济贝类中有机氯农药和多氯联 苯的分布及评价.海洋环境科学，1996，15 (3) :29-35.
技术实现思路
本专利技术旨在建立一种基于不同海水环境条件下牙鲆血细胞免疫粘附活性变化的 快速监测海水中苯并a芘污染的方法。通过在正常海水和含苯并a芘海水中牙鲆的血细胞 对金黄色葡萄球菌的免疫粘附活性的变化，初步建立研究分析海水中苯并a芘的污染情况 及其毒性效应的实验方法。在0. lmol/L PBS++缓冲液体系中，分别采集养殖在正常海水和含苯并a芘海水中的牙鲆血细胞，与金黄色葡萄球孵育，观察计算鱼类血细胞免疫粘附金 黄色葡萄球菌形成Ob受体花环的百分率。将每个血细胞粘附两个及两个以上金黄色葡萄 球菌记为一个花环，计数200个血细胞，算出花环阳性细胞百分率。血细胞Ob受体花环率 =成花环细胞数/200X100%。具体方法和步骤为1.牙鲆血清和菌悬液的制备用无菌注射器分别从实验牙鲆的尾静脉采血，注入5mL离心管中，平放于桌面上， 室温放置30min。待血凝固后，放于4°C冰箱中过夜。吸出析出的血清，分装于1. 5mL灭菌 离心管中，-80°C保存备用。取处理好的金黄色葡萄球菌悬液300 μ L于2mL灭菌离心管中， 加入等体积牙鲆血清，冰上充分混勻后，于20°C孵育30min。每隔IOmin轻轻混勻一次，防 止菌体沉淀。孵育完成后，4°C条件下IOOOOrpm离心5min，菌体沉淀用300 μ L相应缓冲液 重悬，恢复至原来的菌悬液浓度，4°C保存备用。2.牙鲆红细胞的制备从实验牙鲆的尾静脉取血，采用阿氏抗凝剂与牙鲆外周血1 1混合。利用比重 为1. 083的淋巴细胞分离液(TBD公司)分离制备牙鲆红细胞。将最底层的红细胞沉淀用 0. IM PBS于4°C下离心洗涤两次，用血球计数板计数后调整浓度至IX 107mL。然后取适量 红细胞用缓冲液于4°C离心洗涤两次，恢复至1 X 107mL。3.红细胞免疫粘附活性的检测分别取50 μ L用缓冲液处理的菌悬液与红细胞悬液等体积混合，细胞数的比例约 为20 1 (上述操作在冰上进行)，于20°C恒温孵育30min。孵育过程中每隔IOmin轻轻摇 动混勻，防止红细胞和菌体细胞沉淀。孵育完成后，于冰上终止反应。每管加入20 μ L预冷 的0.25%的戊二醛溶液，4°C冰箱中固定15min。取适量孵育液制作涂片，晾干后甲醇固定 anin。每张涂片经Wright’ s染液染色;3min，用蒸馏水冲洗至水流无色为止。晾干后油镜 下观察计算红细胞Ob受体花环率。实验中将每个红细胞粘附两个及两个以上金黄色葡萄 球菌记为一个花环。每个样品涂3张平行片观察计数。红细胞Ob受体花环率=成花环细 胞数 /200X100%。实验结果的统计学处理采用SPSS 13. O统计软件进行t检验分析。本检测方法，主要是做定性检测海洋环境中的有机污染状况，但在需要精确定量 检测时，不建议采用此法。本专利技术检测过程操作简单，所需试剂配制方便，而且不需要使用复杂的仪器设备。 附图说明图1 为正常自然海水中和受到有机污染海水中牙鲆红细胞免疫粘附金黄色葡萄 球菌的粘附状态。图2 苯并a芘加标海水中牙鲆红细胞免疫粘附金黄色葡萄球菌的粘附状态具体实施例方式实施例11.将金黄色葡萄球菌用0. lmol/L PBS缓冲液离心洗涤3次，并调整成浓度为2 X 108CFU/mL的菌悬液，4°C保存备用。2.取50μ L金黄色葡萄球菌悬液分别与在正常海水和含苯并a芘海水中养殖的牙 鲆的红细胞悬液等体积混合，细胞数比例约为20 1，轻轻混勻后，于20°C恒温孵育30min。3.孵育过程中每隔IOmin轻轻摇动混勻，防止红细胞和菌体细胞沉淀。4.孵育完成后，于冰上终止反应。每管加入20yL预冷的0.25%的戊二醛溶液， 4°C固定15min。取适量孵育液制作涂片，晾干后甲醇固定aiiin。5.每张涂片加入适量的feight’ s染液染色;3min，用蒸馏水冲洗至水流无色。晾 干后油镜下观察红细胞对抗原的免疫粘附，计算红细胞Ob受体花环率。6.每个样品涂3张片观察计数取平均值。将每个红细胞粘附两个及两个以上金黄 色葡萄球菌记为一个花环。7. 0. lmol/L PBS++实验组中200个红细胞中形成的花环数记为X1,0. Imol/ LPBS-EDTA阴性对照组中200个红细胞中形成的花环数记为&。8.红细胞C3b受体花环率=(X1-X2)/200 X 100%。实验结果采用SPSS 13. 0软件 进行统计学分析。实施例2选用3L的玻璃烧杯作为实验容器，加入总体积为2L的加标海水，每个烧杯放实验 鱼5尾，每个加标浓度2个平行。苯并a芘浓度梯度0. 49 μ g/L、0. 98 μ g/L、1. 96 μ g/L、 3. 92 μ g/L、7. 84 μ g/L。实验周期14d，温度(20 士 2) °C，24h换加标液，测定血细胞免疫粘附 率的变化情况。1.用2. 5mL无菌注射器从实验鱼尾静脉采血，采用阿氏抗凝剂与牙鲆外周血1 1混合，放于4°C冰箱保存备用2.将金黄色葡萄球菌用0. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
利用鱼类血细胞监测海水苯并ａ芘污染的方法，其特征在于具体的检测分析方法：（１）将金黄色葡萄球菌用０．１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ缓冲液离心洗涤３次，并调整成浓度为２×１０↑［８］ＣＦＵ／ｍＬ的菌悬液，４℃保存备用；（２）取５０μＬ金黄色葡萄球菌悬液分别与在正常海水和含有苯并ａ芘海水养殖的牙鲆的红细胞悬液等体积混合，细胞数比例约为２０∶１，轻轻混匀后，于２０℃恒温孵育３０ｍｉｎ；（３）孵育过程中每隔１０ｍｉｎ轻轻摇动混匀，防止红细胞和菌体细胞沉淀；（４）孵育完成后，于冰上终止反应。每管加入２０μＬ预冷的０．２５％的戊二醛溶液，４℃固定１５ｍｉｎ。取适量孵育液制作涂片，晾干后甲醇固定２ｍｉｎ；（５）每张涂片加入适量的Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ染液染色３ｍｉｎ，用蒸馏水冲洗至水流无色。晾干后油镜下观察红细胞对抗原的免疫粘附，计算红细胞Ｃ３ｂ受体花环率；（６）每个样品涂３张片观察计数取平均值。将每个红细胞粘附两个及两个以上金黄色葡萄球菌记为一个花环；（７）０．１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ↑［＋＋］实验组中２００个红细胞中形成的花环数记为ｘ↓［１］，０．１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ－ＥＤＴＡ阴性对照组中２００个红细胞中形成的花环数记为ｘ↓［２］；（８）红细胞Ｃ３ｂ受体花环率＝（ｘ↓［１］－ｘ↓［２］）／２００×１００％。实验结果采用ＳＰＳＳ １３．０软件进行统计学分析；所述金黄色葡萄球菌悬液的制备方法是：将金黄色葡萄球菌单菌落于ＬＢ液体培养基中，３７℃过夜振荡培养。用０．１Ｍ ＰＢＳ缓冲液离心洗涤两次，用终浓度１％的福尔马林溶液６５℃水浴４０ｍｉｎ将其灭活。取金黄色葡萄球菌悬液３００μＬ于２ｍＬ灭菌离心管中，加入等体积牙鲆血清，冰上充分混匀后，于２０℃孵育３０ｍｉｎ。孵育完成后，４℃条件下１００００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，菌体沉淀用３００μＬ相应缓冲液重悬，恢复至原来的菌悬液浓度，４℃保存备用；所述反应中所用缓冲液及其它液体为：ＰＢＳ缓冲液：ＮａＣｌ ８ｇ，ＫＣｌ ０．２ｇ，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］０．２４ｇ，Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］－１２Ｈ↓［２］Ｏ ２．９ｇ，蒸馏水定容至１０００ｍｌ，ｐＨ７．４；牙鲆血清稀释１０倍。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张振冬，闫启仑，米盛景，王睿睿，王立俊，
申请(专利权)人：张振冬，
类型：发明
国别省市：91
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