一种鱼类组织快速切片方法技术

本发明专利技术属于显微组织切片领域，具体涉及一种鱼类组织快速切片和染色的技术方法，包括以下步骤：１）使用固定液将鱼组织块固定４～６小时，然后将固定后的鱼组织块修切成长２ｍｍ×宽２ｍｍ×高１～２ｍｍ大小的切片组织块，然后使用蒸馏水按照体积比１：１稀释的鸡蛋清浸泡１０～２０秒，进行冰冻切片，然后进行贴片；２）贴片后常温下放置３～５ｍｉｎ，然后进行染色，然后晾干，用中性树胶和盖玻片封片后即可显微镜下观察，该方法不仅缩短了时间，也有效解决了冰冻切片的组织、细胞的溶解、显微镜下图像模糊的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于显微组织切片领域，具体涉及一种鱼类组织快速切片和染色的技术方法。
技术介绍
显微镜观察是对生物组织表面形态、基本结构、细微结构进行观察和分析的有效 实验技术方法，也是临床病理快速诊断和部分形态学研究性工作的重要实验方法。但是，需 要对生物组织进行切片处理、染色后才能进行有效的显微镜观察和分析，常规的实验切片 技术方法包括石蜡切片、冰冻切片方法。石蜡切片技术方法的一般程序是生物组织预先被固定，蛋白质等已经发生变性， 一般是不可逆变性；之后用石蜡对生物组织进行浸蜡(填充细胞、组织便于切片)处理后使 用组织切片机进行切片；再将切片组织中的石蜡浸提，脱蜡的切片组织才能进行染色处理。 主要优点是所得切片的生物组织能够保持原有的基本形态和结构，显微镜下组织形态和结 构较为清晰。而主要缺点是由于要进行石蜡包埋组织快，切片后还需要对组织切片进行脱 蜡处理，所需时间较长，对于一个生物组织样品从取材到进行切片后染色观察的过程，一般 需要6 7天以上；同时，操作程序较为复杂，切片实验工作量较大，对于要进行大批量切片 处理的实验难度较大、工作量大、时间长。冰冻切片技术的一般操作程序是直接将生物组织快进行切片，使用冰冻切片机将 生物组织快进行快速冷冻到_25°C (大约3 5min)后马上进行切片处理，切好的组织片经 过快速固定后，马上进行染色、显微镜观察和分析。冰冻切片技术方法的优点是可以保持生 物组织蛋白质、酶等活性生物分子的生物活性，便于进行组织化学、酶化学和特定生物分子 在细胞、组织中的定位分析；同时，从生物材料经过切片、染色到进行显微镜观察分析所需 要的时间短、操作快速、简便。但是，冰冻切片技术方法的主要缺点是由于生物组织样品没 有进行固定处理，在组织块修切处理、冰冻切片后，细胞和组织内的各类酶、酶原等(如细胞 溶酶体中的酶)被激活后，对生物组织进行一定程度的水解；同时，在_25°C下切成5 8 m 进行冰冻切片后，由于室温一般会高于0°C，导致已经切好的冰冻切片很快出现融化状态。 这些缺点导致冰冻切片操作要求非常快速，同时，染色后的生物细胞、组织的表明形态、细 微结构不清晰，较为模糊。因此，需要研究，既可以将石蜡切片的时间缩短，也可 以解决冰冻切片的组织、细胞的溶解、显微镜下图像模糊的问题。
技术实现思路
本专利技术目的是提供。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是，包括以 下步骤1)使用固定液将鱼组织块固定4 6小时，然后将固定后的鱼组织块修切成长2mmX宽2mmX高1 2 mm大小的切片组织块，然后使用蒸馏水按体积比1 1稀释的鸡蛋清浸泡 10 20秒，立即进行冰冻切片，然后进行贴片；2)贴片后常温下放置3 5min，然后进行染色，染色的过程具体为将切片浸在苏木精 溶液中80s，生理盐水浸洗3s，浸入酸液中3 5 s，生理盐水浸洗3s，碱液中10 15 s，伊 红溶液中1 3s，用质量分数95%的乙醇水溶液浸泡两次，每次5 s，用100%乙醇浸泡两次， 每次5 s，然后晾干，用中性树胶和盖玻片封片后即可显微镜下观察；其中，酸液1000ml水 中加入5ml浓盐酸混勻，所述浓盐酸质量分数38% ；碱液1000ml水中加入5ml浓氨水混勻， 所述浓氨水质量分数28% ；上述生理盐水为鱼用生理盐水，按照质量百分比，所述鱼用生理 盐水的配方为:NaCl 0. 75%, KCl 0. 01%, CaCl2 0. 01%, NaHCO3 0.02%，余量为水。上述技术方案中，步骤1)中，所述鱼组织块包括鱼肠道组织、鱼肝胰脏组织及其 它组织；为了实现良好的固定效果，所述鱼组织块的尺寸为长5 SmmX宽5 SmmX高3 mmD上述技术方案中，步骤1)中，将鱼组织块固定前，先将鱼组织块在鱼用生理盐水中 洗净，然后用吸水纸吸干表面水分。上述技术方案中，步骤1)中，所述固定液为鲍音(Bouin’ s)液，所述鲍音 (Bouin' s)液的配置方法为饱和苦味酸75ml中加入福尔马林00%甲醛)25ml再加入冰 醋酸5ml混勻。上述技术方案中，步骤1)所述冰冻切片步骤中，样品台(冷台)温度设定为-25°c、 刀片温度设定为-20°C ；将切片组织块快速贴在样品台(冷台)上进行切片；优选地，将面积 最大的一面贴向样品台，3 5min后即可进行切片；切片厚度要求为肠道为4 5 μ m，肝 胰脏为2 5 μ m，其他组织5 8 μ m。上述技术方案中，步骤1)所述贴片步骤中，直接用洁净的载玻片将切下的组织片 迅速贴片，一张载玻片可以贴2 4张切片材料；该步骤中，由于稀释的鸡蛋清既可以作为 包埋剂，同时又作为粘贴剂，因此载玻片可以不再使用粘贴剂。上述技术方案中，步骤2)中，整个染色过程中，将切片放入和拿出溶液时动作要柔 和，以防脱片；所述酸液不加乙醇只用鱼用生理盐水，可以避免造成脱片。由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点1、本专利技术中，将新鲜的鱼类组织样本经过4 6小时的苦味酸固定后，使用冰冻切片机 在进行冰冻切片，冰冻切片不需再进行固定，只需要简单脱去苦味酸后即可进行染色、封片 处理、显微镜观察，得到实验结果。从鱼体取出组织块样品，经过固定、冰冻切片、组织染色、 树胶封片，到进行显微镜观察得到实验结果，可以在8小时以内得到实验结果；因此，不仅 缩短了时间(石蜡切片需要6 7天才能得到实验结果)，也有效解决了冰冻切片的组织、细 胞的溶解、显微镜下图像模糊的问题。2、本专利技术组织切片快速、操作简便，适合与快速切片检测、形态观察和细微结构 观察分析。从组织取样到显微镜观察结果只需要8小时即可完成。3、本专利技术适合于鱼类组织切片观察和分析，整个操作程序、溶液配制、染色程序 和方法等，均适合鱼类组织切片的需要。4、本专利技术适合于对批量的鱼类组织切片需要，对于病理切片、基础研究切片等样 本数量多、批处理量大的检测和研究工作特别适用。5、本专利技术切片质量高，组织片与载玻片粘合牢固、不易掉片；组织、细胞染色效果 好，显微镜下组织、细胞的图像清晰、反差明显；重复性好，切片封片后可以长时间保存。附图说明图Ia为实施例中采用常规冰冻切片得到的草鱼肠道切片； 图Ib为实施例中采用实施例一的切片方法得到的草鱼肠道切片； 图Ic为实施例中采用常规石蜡切片方法得到的草鱼肠道切片； 图加为实施例中采用常规冰冻切片得到的草鱼肝胰脏切片；图2b为实施例中采用实施例一的切片方法得到的草鱼肝胰脏切片； 图2c为实施例中采用常规石蜡切片方法得到的草鱼肝胰脏切片； 图3为实施例中采用实施例一的切片方法得到斑点叉尾鮰皮肤粘膜层。具体实施例方式下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述 实施例一，所述鱼类组织包括鱼类肠道组织、草鱼肝胰脏、斑点叉 尾鮰皮肤，具体包括以下步骤⑴组织块的固定方法将要切片的组织块路快速修剪成长5 SmmX宽5 SmmX高 3 mm大小，在0.75%生理盐水中洗净、吸水纸吸干表面水分，立即放入Bouin’ s液中进行 固定，4 6小时后即可进行切片。Bouin’ s液饱和苦味酸75ml中加入福尔马林00%甲 醛)25ml再加入冰醋酸5ml混勻。⑵冰冻切片方法组织块进一步修切用薄刀片将固定后的组织块进一步修切成 2mmX宽2mmX高1 2 m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鱼类组织快速切片方法，其特征在于，包括以下步骤：１）使用固定液将鱼组织块固定４～６小时，然后将固定后的鱼组织块修切成长２ｍｍ×宽２ｍｍ×高１～２　ｍｍ大小的切片组织块，然后使用蒸馏水按照体积比１：１稀释的鸡蛋清浸泡１０～２０秒，进行冰冻切片，然后进行贴片；２）贴片后常温下放置３～５ｍｉｎ，然后进行染色，染色的过程具体为：将切片浸在苏木精溶液中８０ｓ，生理盐水浸洗３ｓ，浸入酸液中３～５ｓ，生理盐水浸洗３ｓ，碱液中１０～１５ｓ，伊红溶液中１～３ｓ，用质量分数９５％的乙醇水溶液浸泡两次，每次５ｓ，用１００％乙醇浸泡两次，每次５ｓ，然后晾干，用中性树胶和盖玻片封片后即可显微镜下观察；其中，酸液：１０００ｍｌ水中加入５ｍｌ浓盐酸混匀，所述浓盐酸质量分数３８％；碱液：１０００ｍｌ水中加入５ｍｌ浓氨水混匀，所述浓氨水质量分数２８％；上述生理盐水为鱼用生理盐水，按照质量百分比，所述鱼用生理盐水的配方为：ＮａＣｌ　０．７５％，ＫＣｌ　０．０１％，ＣａＣｌ↓［２］　０．０１％，ＮａＨＣＯ↓［３］　０．０２％，余量为水。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶元土，蔡春芳，殷永风，张宝彤，向朝林，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]