优化的登革病毒进入抑制肽（ＤＮ８１）制造技术

本发明专利技术涉及肽进入抑制剂和确定这些能与具有ＩＩ类Ｅ蛋白、例如登革病毒Ｅ蛋白的病毒的区域结合的抑制剂作为体内抗病毒化合物候选物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】优化的登革病毒进入抑制肽(DN81)相关申请的交叉引用本国际专利申请要求2007年7月13日提交的美国临时申请号60/949，710的优 先权和利益其通过弓I用并入本文。本专利技术涉及能与病毒区域结合的抑制剂。更具体而言，本专利技术涉及能与登革病毒 包膜糖蛋白或登革病毒E蛋白，一种II类病毒E蛋白，中的区域结合的抑制剂。再具体而 言，本专利技术涉及肽进入抑制剂和确定这些能与登革病毒E蛋白区域结合的抑制剂作为体内 抗病毒化合物候选物的方法。
技术介绍
登革病毒是黄病毒家族成员，施加了任何蚊媒病毒病原体的最大社会和经济负担 之一。没有感染的特异性疗法，通过疫苗接种控制登革病毒已证明难以实现。几种其他的 黄病毒是重要的人病原体，包括黄热病毒、西尼罗河病毒、蜱传脑炎病毒(TBE)和日本脑炎 病毒(JE)。包膜病毒通过膜融合进入细胞。黄病毒的结构蛋白E介导受体结合和融合两者， 是所谓的“II类”病毒融合蛋白。目前为止已鉴定了两类病毒“融合器(fusion machine)”。 I类病毒融合蛋白包括粘和副粘病毒(例如流感病毒)、逆转录病毒(例如HIV)和纤丝病 毒(例如埃博拉病毒)。II类融合蛋白不仅发现于黄病毒(黄热病毒、西尼罗河病毒等)， 还发现于α病毒，其包括塞姆利基森林病毒和辛德比斯病毒以及丙型肝炎病毒。这两类的 结构特征区别很大，但其均完成了同样的任务，即融合两个脂双层。人们更为熟悉的I类融合蛋白，例如流感病毒的血球凝集素(HA)和HIV的gpl20/ gp41，在内部切割位点的N末端或其附近具有“融合肽”。该疏水和富含甘氨酸的片段包埋 于I类融合蛋白的预切割处理(cleaved-primed)三聚体中，当低pH值(HA情况下)、受体 结合(gpl20/gp41情况下)或其他细胞进入相关信号引发大规模构象重排时显露出来。随 后的可能事件包括融合蛋白与靶细胞膜的相互作用和三聚体的再折叠。后一步骤使融合肽 与病毒膜锚着点聚集在一起，从而结合细胞和病毒膜，启动双分子层的融合过程。目前为止在黄热病毒和α病毒中发现的II类蛋白已进化出结构不同但机理相关 的融合构造。在I类蛋白中，溶蛋白性裂解(黄病毒中从PrM到Μ，α病毒中从ρΕ2到Ε2) 产生成熟病毒体，融合蛋白处于亚稳构象，为融合而准备好的(primed)。融合肽，蛋白延长 的亚结构域尖端的内环，包埋在蛋白界面，在暴露于低pH值引发的构象变化中显露出来。II类病毒融合蛋白的融合机制尚未清楚地理解，也没有理论能特异性地抑制这些 蛋白的融合。目前为止仅确定了一种黄病毒和一种α病毒包膜蛋白的前融合结构。因此 需要能特异性抑制黄病毒、α病毒和肝炎病毒的病毒感染的进入抑制剂。此外，由于融合 是病毒感染中的关键步骤，关于包括登革病毒包膜蛋白在内的II类包膜蛋白机制的更好 理解，以及鉴定这些蛋白内可被药物靶向的(druggable)区域将进一步开发能特异性抑制 黄病毒、α病毒和肝炎病毒的病毒感染的疗法。专利技术概述本专利技术提供了可与II类病毒E蛋白中的区域结合的肽进入抑制剂。抑制剂与所述区域的相互作用，或抑制剂对所述区域活性的调节可抑制病毒融合，由此抑制病毒感染。 一方面，本专利技术提供了化合物和筛选针对这些可结合区域的化合物的方法，以发现由含II 类蛋白的病毒引起疾病的治疗候选物。可筛选治疗候选物的疾病包括登革热、登革出血热、 蜱传脑炎、西尼罗河病毒疾病、黄热病和丙型肝炎。在一个实施方案中，鉴定由含II类E蛋白的病毒引起的疾病的治疗候选物的方法 包括使包含可结合区域的II类E蛋白与化合物接触，其中所述化合物的结合表明其为治疗 候选物。化合物可选自包括肽类的化合物。结合可在体外或体内测定。在某些实施方案中， 所述蛋白是登革病毒E蛋白。这些可结合区域同样可用于结构测定、药物筛选、药物设计和 本文中描述和要求的其他方法中。 此外，本专利技术提供了抑制登革病毒的病毒传染和/或登革病毒的病毒体包膜与靶 细胞膜之间结合(将病毒基因组递送至细胞质内的过程)的方法。本专利技术提供了采用肽类 或肽衍生物抑制登革病毒与细胞结合的方法。本专利技术提供了治疗由登革病毒诱导的疾病的 方法。在本专利技术的另一个实施方案中，肽进入抑制剂包括SEQ ID NO :1所示的氨基酸序 列。在本专利技术的又一个实施方案中，确定病毒抑制剂的方法包括使肽与病毒可结合区 域接触，以及确定该化合物与病毒可结合区域结合度的步骤，其中化合物的结合度衡量了 该化合物对病毒的活性。在本专利技术的又一个实施方案中，治疗登革病毒感染的方法包括施用治疗有效量肽 的步骤，其中所述肽具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。附图简述附图说明图1显示了登革病毒的基因组结构；图2是DN81肽针对DENV-2的剂量响应抑制曲线示意图；图3是DN81肽错义序列针对DENV-2的剂量响应抑制曲线示意图；以及图4是DN81肽在不同浓度下细胞毒性测试示意图。专利技术详述本专利技术的一个实施方案涉及抑制登革感染的方法，包括抑制病毒体包膜与细胞膜 的融合，将病毒基因组递送到细胞质中的过程。根据本专利技术，可使用任何抑制登革病毒包膜与细胞膜融合的肽或蛋白(包括那些 感染人类以及非人类宿主的登革病毒)。在本专利技术不同的实施方案中，这些登革肽进入抑制 剂可包括但不限于与几种登革病毒蛋白膜相互作用可结合区域相关的肽类。登革病毒的 基因组结构如图1所示。术语“可结合区域”，当用于肽、核酸、复合物等时，是指登革病毒E蛋白或其他II 类E蛋白的区域，其是结合减少或抑制病毒感染性的试剂的靶标或可能的靶标。对于肽来 说，可结合区域通常指这样的区域其中肽的某几个氨基酸能够与登革病毒E蛋白的至少 部分相互作用。对于肽或其复合物来说，可结合区域包括结合口袋和位点，肽或复合物结构 域间的界面、肽或复合物的表面沟或轮廓或表面，其能够参与和另一个分子的相互作用，例 如细胞膜。在一个实施方案中，登革肽进入抑制剂是DN81，其具有SEQ IDNo. 1的序列RWMVffRHWFHRLRLPYNPGKNKQNQQffP。在本专利技术的另一个实施方案中，与登革肽进入抑制剂有关的肽类包括同源性肽。 本文中，术语“同源性登革肽进入抑制剂”应当理解为具有与登革病毒抑制蛋白和肽类相应 部分相同序列的肽，其中一个或更多个氨基酸被功能等价的氨基酸替换。该术语同样指这 些肽的衍生物，包括但不限于苄基化衍生物、糖基化衍生物，以及包括天然氨基酸对映体的 肽。在本专利技术的其他实施方案中，登革肽进入抑制剂、相关肽或衍生物与载体分子例 如蛋白连接。根据本专利技术的该实施方案，可使用的蛋白质包括但不限于人血清白蛋白。根 据本专利技术，包括附加氨基酸的登革肽进入抑制剂也是有用的。本专利技术的登革进入抑制肽可用于抑制登革病毒病毒体与细胞的融合，因此可用于 治疗哺乳动物的登革病毒感染。这些哺乳动物是患者，包括但不限于人类、狗、猫、鸟、马等。 本专利技术的肽可以任何无菌的生物相容性药用载体施用给患者，包括但不限于盐水、缓冲盐 水、葡萄糖和水。向患者施用肽的方法是本领域技术人员熟知的，其包括但不限于皮内、肌 内、腹膜内、静脉内、皮下、口服和鼻内。此外，需要通过任何适宜的途径、包括静脉内注射将 本专利技术的药物组合物引入中枢神经系统。其他实施方案预期了登革进入抑制肽或其衍生物 的施用，其与包括人本文档来自技高网...

【技术保护点】
肽进入抑制剂，其包括：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：SF迈克尔，S伊塞尔恩，R加里，R萨穆德拉拉，J科斯丁，E延维蒂苏克，
申请(专利权)人：佛罗里达州墨西哥湾海岸大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]