本发明专利技术公开了一种Ｈ１Ｎ１猪流感病毒血凝素模拟抗原表位及其应用，属于分子免疫学领域。其利用噬菌体肽库展示技术，获得了Ｈ１Ｎ１猪流感病毒血凝素空间构象的模拟抗原表位，该表位是由１２个氨基酸残基构成的短肽。本发明专利技术还公开了该模拟表位在Ｈ１Ｎ１猪流感病毒感染诊断试剂方面的应用，其可以使Ｈ１Ｎ１猪流感的检测更加快速，简便，准确。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子免疫学
，涉及一种能模拟Hmi猪流感病毒血凝素抗原 表位的12肽及其在制备Hmi猪流感病毒抗体检测试剂上的应用。
技术介绍
流感病毒(Influenza virus)属正粘液病毒科，流感病毒属，为单股负链RNA病 毒，由大小不等的8个独立片段组成。根据病毒抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒 分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒根据血凝素(H)和神经酰胺酶(N)的不同又分为许多 亚型，H可分为15个亚型(Hl H16)，N有9个亚型(附 N9)，其中感染人和猪的主要 是A型流感病毒H1N1、H2N2、H3N2。已有研究表明，猪能感染多种流感病毒，是流感病毒的 “混合器”。2009年甲型Hmi流感病毒在人际间大规模流行，对人类健康构成严重威胁。 遗传分析显示,这个病毒就含有猪流感的基因成分CTransmission and Reassortment of Pandemic HlNl/2009Influenza A Virus in Swine. D. Vijaykrishna, et al，SCIENCE VOL 328 18JUNE 2010)。Him亚型引起的猪流感已有近百年历史，1918年美国首次报道，1930 年Shope从猪体中首次分离到Hmi亚型猪流感病毒，即A/Swine/Iowa/30 (HlNl)。猪流感 病毒(Swine influenza virus, SIV)基因组大约为 13. 6kb，其中血凝素(hemagglutinin， HA)基因在流感病毒传染的过程中与识别靶细胞表面受体在穿膜过程中起重要作用，刺激 机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染。目前Hmi猪流感病毒的实验室诊断主要基于核 酸RT-PCR和荧光定量RT-PCR，缺乏简便特异的免疫学诊断方法。因此，研制抗体检测相关 试剂，对Hmi型流感病毒的研究、诊断、治疗及控制具有重要意义。免疫学研究表明，引起免疫应答的主要成份是蛋白抗原，而起决定作用的又是蛋 白抗原上的抗原决定簇即抗原表位。血凝素(hemagglutinin，HA)是流感病毒的主要外膜 蛋白，是流感病毒最重要的蛋白抗原之一。HA具有免疫原性，能使人体产生保护性抗体，但 其容易变异，是流感流行的主要原因之一，也是流感病毒检测的靶标之一。随着人们越来越 对Hmi猪流感病毒的关注，HlNl猪流感病毒血凝素抗原表位的获得和应用也成为研究焦 点。由于基因工程技术和免疫学的发展，人们能够鉴定抗原表位，并且可对其氨基酸序列进 行分析研究，使得抗原表位的获得成为可能。噬菌体展示技术是一项十九世纪初发展起来的新的基因操作技术，它将外源多肽 或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子 的DNA则位于病毒粒子内。使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶 分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过淘选得以快速鉴定(Identification and Charaterization of Peptides Mimicking theEpitopes of Metal loprotease of Schistosoma Japonicum，CMI，2005，2 (3))。从噬菌体随机肽库中筛选抗原表位的基本原理 是生物淘选，可使用纯化的单克隆抗体、阳性血清IgG或重组表达蛋白为靶分子进行淘选， 可以筛选出与原始抗原序列完全相同的线性表位抗原，也能筛选出与原始抗原序列不完全 相同但功能相似的构象表位抗原，即模拟表位抗原(Schistosoma japonicum Jsolationandldentification of Peptides Mimicking Ferritin Epitopes from Phage Display Library. ActaBiochimica et Biophysica Sinica. 2004,36(3))。
技术实现思路
本专利技术的目的是筛选一种Hmi猪流感病毒血凝素模拟抗原表位。本专利技术的另一个目的是提供上述Hmi猪流感病毒血凝素模拟抗原表位在制备 HlNl猪流感病毒血清学诊断试剂中的应用，使得Hmi猪流感的检测更加快速，简便和准确。—种Hmi猪流感病毒血凝素模拟抗原表位，是由12个氨基酸残基构成的短肽，其 氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示SEQ ID NO 1 =Gly-Leu-Leu-Arg-Ser-Leu-Thr-Tyr-Glu-Ala-Val-Argo编码所述的Hmi猪流感病毒血凝素模拟抗原表位的核苷酸序列包括SEQ IDNO 2 5' -GGT CTT TTG CGT TCT TTG ACT TAT GAG GCT GTG CGT-3，。所述的Hmi猪流感病毒血凝素模拟抗原表位能制备Hmi猪流感病毒抗体检测试 剂，如试剂盒等。本专利技术中Hmi猪流感病毒血凝素模拟抗原表位是通过用Hmi猪流感病毒血凝素 免疫小鼠血清IgG对噬菌体12肽库(New England Biolabs公司产品)进行筛选得到的。 通过逐渐减少包被的Hmi猪流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG的浓度并提高漂洗液中吐 温-20的浓度，逐渐加大筛选压力使洗脱下的噬菌体与Hmi猪流感病毒血凝素免疫小鼠血 清IgG的亲和力越来越高，特异性越来越强，通过3轮筛选最终得到与Hmi猪流感病毒血 凝素免疫小鼠血清IgG高特异性结合的噬菌体。经噬菌体阳性鉴定、单克隆化后提取噬菌 体克隆单链DNA，测序后按噬菌体专用密码子表翻译出展示于噬菌体表面的12肽氨基酸残 基序列。通过免疫印迹鉴定、生物软件等方法的分析，确定为HlN 1猪流感病毒血凝素空间 构象模拟抗原表位。制备本专利技术Hmi猪流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位的过程为1、以Hmi猪流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG 100 μ g/mL包被酶标板，4°C过夜， 加入封闭液，用TBST洗涤后，每孔加入稀释的噬菌体随机12肽库，室温孵育1小时，倒掉液 体，用含0. 1% tween-20的TBST缓冲液洗涤，用洗脱液洗下特异性结合的噬菌体，取少量 进行噬菌体滴度测定，其余的转入新鲜菌液E. coliER2738 (OD600为0. 5左右)中进行扩增， PEG-8000/氯化钠沉淀回收噬菌体，扩增的噬菌体在测定滴度后用于下一轮筛选。后面2 轮筛选中，包被的Hmi猪流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG浓度逐渐降低，同时漂洗液中 tween-20的浓度提高到0. 5%。2、经过3轮结合一洗脱一扩增的淘筛，对第三轮洗脱液铺板，挑取单个噬菌体克 隆接种到含E. coliER2738的培养液中扩增，PEG-8000/氯化钠沉淀回收噬菌体。用噬菌体 ELISA法对噬菌体进行阳性鉴定用扩增的单克隆噬菌体(以野生型M13噬菌体作对照)加 入到包被有Hmi猪流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG的酶标板上，以HRP标记的鼠抗M13 抗体(New England Biolabs公司产品)为二抗，TMB为底物进行显色。用dot-ELISA法进 一步鉴定噬菌体克隆特异性将单个噬菌体克隆点在PDF膜上(以野生型M13噬菌体作对 照)，与Hmi猪流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG孵育，以HRP标记本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Ｈ１Ｎ１猪流感病毒血凝素模拟抗原表位，其特征在于，是由１２个氨基酸残基构成的短肽，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱忠武，唐连飞，肖家勇，孟芳，胡宇东，赵和平，候义宏，禹思宇，欧阳振宇，
申请(专利权)人：湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]
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