本申请揭示了用于单分子药物筛选、发现和验证的方法和装置。这些方法和装置允许使用者使用单分子的观察结果快速检测药物候选物是否和如何干扰特定疾病路径所涉及的靶酶。本文所述的方法和装置利用单分子操纵和检测技术（例如，光镊或磁镊）来直接检测靶酶－底物相互作用的特征动力学或“机械特征（ｍｅｃｈｉｎａｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）”是否实质上由药物候选物改变或调节。此外，所述方法和装置适用于分析机械特征的调节以便鉴别药物候选物的潜在干扰机制。本发明专利技术的一方面中，本文所揭示的方法和装置涉及监测在抑制或者调节聚合过程的药物候选物存在下个别聚合酶分子（例如ＤＮＡ聚合酶、ＲＮＡ聚合酶和逆转录酶）沿多核苷酸底物的实时动力学机械特征。所述药物候选物的鉴别和分析对于抗病毒、抗癌和抗生素药物的开发至关重要。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及耙向包括DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶的酶的药物候 选物的筛选和验证。
技术介绍
在临床使用中，大约百分之三十的药物抑制疾病相关酶促过程(瑞.艾.科 普兰(Copeland，R.A.),药物发现中的酶抑制剂的评估药物化学家和药理学 家指南(Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery: a guide for medicinal chemists and pharmacologists).(威立国际-牛学公司 (^Wiley-Interscience )， 2005))。因此，新颖酶抑制剂的发现是生物化学和药理学中的重要研究领域。聚合酶抑制剂在临床和研究设定中具有价值。这些抑制剂有助于阐明转录 和DNA复制的机理方面，有助于绘制结构-功能关系，且有助于表征蛋白质活 性。聚合酶抑制剂还是最吸引人的药物靶之一。关于这些抑制剂、其结构和其 机制的知识使得能够设计将有效抵抗新病原体和已知病原体的抗生素抗性突 变体的新药物，诸如抗癌剂、抗病毒剂和抗生素。因为已报道这些抑制剂中的 一些诱导和/或抑制细胞凋亡，所以其也提供用于研究细胞凋亡的有价值工具。 同样，因为这些药剂中的一些阻断DNA转录的特定步骤，所以聚合酶抑制剂 可有助于阐明在各种健康和疾病状态下转录控制在调控靶基因表达中的作用。靶向特定疾病路径所涉及的聚合酶蛋白质的药物为本领域所熟知。举例来 说，逆转录酶抑制剂(reverse transcriptase inhibitors, RTI)是一种通过抑制逆 转录酶的活性而耙向病毒DNA的构建的抗逆转录酶病毒药物。存在两种具有 不同作用机制的RTI亚型核苷和核苷酸类似物RTI被并入病毒DNA中，从4而导致链终止，而非核苷类似物RTI则充当逆转录酶的竟争性抑制剂。当前通 过抑制fflV逆转录酶而起作用的AIDS治疗剂在本领域中有所描述(参见例如， 宾(Bean)等人，应用与环境微生物学(Appl Environ Microbiol) 72:5670-5672(2005 ))，且包括依发韦仑(Efavirenz)(商标名称SUSTIVA⑧和STOCRIN ) 和奈韦拉平(Nevirapine)(也以商品名称VIRAMUNE辦肖售)。耙向聚合酶蛋 白质(例如利福平(rifampin))的抗生素和耙向聚合酶蛋白质(例如顺柏(cisplatin ))的癌症药物也为本领域中所已知。已发现许多药物有效治疗癌症。这些药物包括不同化合物，诸如抗代谢物(例如，曱氨蝶呤(methotrexate)和氟尿嘧吱(fluorouracil))、 DNA损伤剂(例如，环磷酰胺(cyclophosphamide )、顺铂和阿霉素(doxorubicin))、有丝 分裂抑制剂(例如，长春新碱(vincristine ))、核苷酸类似物(例如，6-巯基噪 呤)、DNA修复所涉及的拓朴异构酶的抑制剂(例如，依托泊苷(etoposide))、 DNA聚合酶的抑制剂(例如，博莱霉素(bleomycin))和嵌入剂(intercalating agent, ^口米4乇'蒽酉昆(mitoxantrone))。目前，正在研究数种靶向哺乳动物DNA复制的酶的药物来作为用于癌症 化学疗法的有前途候选物或作为用于了解特定酶在DNA复制和修复中的作用 的探针。这些潜在药物候选物包括补骨脂曱素(corylifolin)、补骨脂酚(bakuchiol)、白藜声醇(resveratrol )、新补骨脂异黄酮(Neobavaisoflavone) 和黄豆苦元(daidzein)(参见孙(Sun)等人，天然产物化学杂志(J. Nat. Prod.) 61,362-366 ( 1998))。DNA和RNA聚合酶抑制剂的其它实例包括放线菌素D( Actinomycin D )、 链霉菌属的种(浙e/7tom戸s sp.); a-鶴膏毒肽(a-Amanitin )、我鸟膏属(爿應w'to sp.);阿非迪霉素(Aphidicolin)、 HSV复制抑制剂、BP5; a-鹅膏毒肽油酸曱 酯；新生霉素(Novobiocin).钠盐；利福平；RNA聚合酶III抑制剂；和7-氨基-放线菌素D。目前在II期试验中用于抵抗丙型肝炎病毒的三种聚合酶抑 制剂是艾德尼克斯公司/诺华公司(Idenix/Novartis )的瓦洛他滨(valopicitabine )(NM283 );维诺公司(ViroPharma)的HCV-796;和罗氏公司(Roche)的 R1626。罗氏公司(Roche)/艾德尼克斯公司(Idenix)也在作为HBV治疗初 始成功后的II期HCV试验中研究伐托他滨(valtorcitabine， val-LdC )，第一链病毒DNA合成抑制剂。DNA损伤剂提供一些用于癌症的最成功治疗。多聚(ADP-核糖)聚合酶 (即PARP)可有助于修复由用于治疗癌症的DNA损伤剂引起的DNA损伤。 因为PARP活性常常在癌细胞中增加，所以其提供这些细胞的存活机制。举例 来说，ABT-888 (雅培肿瘤学公司(Abott Oncology ))是由雅培公司(Abbott) 开发用于防止癌细胞中的DNA修复且增加常见癌症疗法(诸如放射和烷基化 剂)的有效性的口服PARP抑制剂。此外，临床前数据表明ABT-888改善放 射和许多类型的化学疗法在动物癌症模型中的有效性。这些选自最近5年的公开出版物说明关于聚合酶抑制剂的活性、机制和生 物化学的当前技术水平杰 艾 布朗(Brown JA),威 瓦.杜姆(DuymWW),杰 德 福勒 (Fowler JD )，佐.索(Suo， Z.) . (2007)"在由人类DNA聚合酶X和卩催化 的缝隙填补合成期间8-氧代-7，8-二氢-2'-脱氧乌苷的诱变潜力的单转换动力学 分才斤 (Single-turnover Kinetic Analysis of the Mutagenic Potential of 8國Oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine during Gap-filling Synthesis Catalyzed by Human DNA Polymerases lambda and beta)."分子生物学杂志(J Mol Biol.)。佐.索(Suo，Z.),玛 艾 阿卜杜拉(AbdullahMA) . (2007)"丙型肝 炎病毒NS2-3蛋白酶的独特复合活性位点抗病毒药物设计的新时机(Unique Composite Active Site of the Hepatitis C Virus NS2- 3 Protease: a New Opportunity for Antiviral Drug Design).，，化学与医药化学(ChemMedChem.) 2(3), 283-284。玛.普.勒特格(RoettgerMP),卡.玛 费埃拉(FialaKA),斯.桑帕 理(Sompalli S )，伊.东(Dong Y)，佐 索(Suo Z) . (2004)"人类DNA 聚合酶mu的保真度的稳态前动力学研究(Pre-st本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于筛选药物候选物的方法，其中所述方法包含： （ａ）使靶酶与所述靶酶的底物接触； （ｂ）通过使用单分子检测装置进行机械测量来确定在所述靶酶的所述底物存在下所述靶酶的基线机械特征； （ｃ）使所述靶酶和所述靶酶的所述底物与 一种或一种以上药物候选物接触； （ｄ）通过使用单分子检测装置进行机械测量来确定在所述靶酶的所述底物和一种或一种以上药物候选物存在下所述靶酶的机械特征；以及 （ｅ）比较步骤（ｂ）的所述基线机械特征与步骤（ｄ）的所述机械特征；其中： 步骤（ｂ）的所述基线机械特征和步骤（ｄ）的所述机械特征使用同一单分子检测装置和相同机械测量得以确定。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：阿妮塔高尔，
申请(专利权)人：纳诺拜希姆公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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