纯化因子ＶＩＩＩ和Ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子的方法技术

本发明专利技术涉及纯化方法，包括从选自（ｉ）含有ＦＶＩＩＩ和ＦｖＷ的混合物的溶液，（ｉｉ）含有ＦｖＷ的溶液，（ｉｉｉ）源于非人动物的分泌物的溶液，和（ｉｖ）源于含有ＦＶＩＩＩ的植物提取物的溶液开始在离子交换色谱过滤型膜上吸附ＦＶＩＩＩ或ＦｖＷ的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利
涉及在药物中用作活性剂的因子VIII以及VonWillebrand因子的纯 化。现有技术 因子VIII(下面也称作FVIII)是以低浓度存在于人血浆中的血浆蛋白质。然 而，其代表了凝结级联中的关键点。事实上，这一蛋白质起因子IX(或FIX)的辅因子的 作用以便活化因子X (或FX)。 一旦被活化，因子X将凝血酶原转变成凝血酶，后者再将 纤维蛋白原转变成纤维蛋白，从而导致止血纤维蛋白凝块的形成。 罹患A型血友病的人具有FVIII缺陷，这自发地或在源于事故或外科手术的创伤 后造成严重的失血。 通常通过注射纯化的血浆源FVIII来治疗那些个体。由于此注射通常为多次且重复，所以可获得高纯度FVIII浓縮物是至关重要的。事实上，如果FVIII浓縮物未充分纯化，它们可能含有大量的纤维蛋白原和免疫球蛋白，这可能诱导不期望的免疫应答。 因此，提供血浆源蛋白质用于治疗目的需要血浆源FVIII纯化方法以获得高纯度产物。 最通常从冷沉淀的人血浆级分来制备因子VIII浓縮物。通常在工业中心获得 的用于治疗人血浆的因子VIII浓縮物的纯度通常约1IU/mg并且通常不超过10至20IU/ mg的最大范围。最常见的纯化方法都意味着沉淀步骤，该步骤针对于除去(通常不够充 分)蛋白源污染物如纤维蛋白原、纤连蛋白以及免疫球蛋白。这些方法可使用或组合低温 沉淀(10°C )，或者添加蛋白沉淀剂，像亲水聚合物如PEG (Newman等人，Br. J. Haemato121 : 1-20，1971 ;Hao等 人，Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press 1980， pp. 57-74)，聚乙烯妣咯烷酮(Casillas和Simonetti， Br. J. Haemato, 50 :665-672， 1982)、葡聚糖、聚糖体、珀可、羟乙基淀粉以及氧化铝也被建议用作沉淀剂。Thorell和 BlombSck推荐的甘氨酸以及氯化钠的使用(Thorell和Blomb3ck, Thromb Res. 1984 Aug 15 ;35(4) :431-50)也适用于沉淀剂。类似地，一些作者(Ng等人，ThrombosisRes.， 42 :825-834,1986)成功地将三种沉淀剂PEG、甘氨酸和氯化钠组合以获得具有比活性在10 至16IU/mg范围的因子VIII浓縮物。 也通过在生产过程中包括与多孔硅珠的接触步骤来生产因子VIII浓縮物，该接 触步骤旨在截留低分子量蛋白源污染物(Margolis等人，VoxSang. 46 :341-348， 1984)。产 物的比活性仍旧保持相对较差lUI/mg。 出现了制备非常高纯度因子VIII浓縮物的方法。事实上，提出了通过免疫亲 禾口色i普f去来获f寻 农缩净勿(Zimmerman禾口 Fulcher， Thrombosis Res. ， Suppl. VII， p. 58， 1987 ;Berntorp禾口 Nilsson， Thrombosis Res. ， S聊l. VII， p. 60， 1987 ;Levine等人， Thombosis Res，Su卯l.VI1，1987)。此种方法在于利用固定到色谱底物的抗因子VIII :C或 抗Von Willebrand因子抗体的方法来纯化因子VIII。此种方法是有效的但是却需要烈性(drastic)溶液的使用以将因子VIII从其抗体或从Von Willebrand因子解吸附。因此需 要针对于除去不想要的化学剂的其他超滤步骤，但是这可能影响因子VIII的生物活性。生 产期间，因子VIII的比活性可达到4000至10000IU/mg，但是其不稳定性需要在冻干步骤前 加入稳定剂例如白蛋白，这将因子VIII的比活性降至3-5IU/mg。然而，免疫亲和纯化的主 要缺点在于动物源残留抗体的存在并因此可能在患者中造成针对那些非人蛋白质的免疫 反应的发生。 因此，通过可用于大规模工业环境的方法，所有这些方法都不允许提供完全没有 非人蛋白质如动物源抗体的极高纯度的因子VIII浓縮物。 EP 0 343 275描述了从冷沉淀物制备因子VIII的方法，其特征在于，在病毒灭活 处理之前，冷沉淀物悬浮于pH值在6. 5至7. 5范围的含有1至3U/ml肝素的水中，与氢氧 化铝悬液反应并在IO至18t:的温度下冷却以及将pH值调整至6至7的范围，离心或过 滤，然后再经过后处理，尤其是通过使用亲水型离子交换树脂如Fractogel-DEAE(现在称 作DEAE-TOYOPEARL⑧，由Tosoh Bioscience公司出售)的色谱法进一步进行纯 化。 这一文本因而描述了通过将非常特殊的预备步骤(尤其是特征为完全没有任何 乙醇处理)与在亲水型树脂如Fractogel DEAE上的离子交换色谱联合使用，而只纯化因子 VIII。 EP 0 359 593描述了阴离子交换色谱纯化方法，其使得在经深思熟虑而不需 要任何后处理的条件下，在单个色谱柱上分离预期的蛋白质。此种方法使得能够从人或 动物血浆分离因子VIII、纤维蛋白原、纤连蛋白和Von Willebrand因子蛋白质。此种 方法可总结如下将溶解于水的冷沉淀物级分通过使用基质为大交联乙烯聚合物凝胶类 型的阴离子交换树脂的色谱法进行单次分离，该树脂由于其孔隙率特性而能够留住因子 VIII-VonWillebrand因子复合物，然后通过连续增加洗脱缓冲液的离子强度而选择性地收集多种蛋白质。此种方法通过使用接枝到Fraetoge1⑧tsk-deae650树脂上的deae部分(现称作DEAE-TOYOPEARL⑧，由TosohBioscience公司出售)而得到很好的结 果。然而，此种方法虽然能获得纯化的FVIII，但不能获得足够纯的Von Willebrand因子。 另一方面，Von Willebrand因子(下文也称作FvW)通过发挥下述两种不同功 能而在止血起至关重要的作用，即作为粘着蛋白，它允许血小板分散，粘附并聚集到血管 内皮下膜上，并因此参与损伤血管的快速愈合，以及另一方面，其保证因子VIII稳定并运 输到血液循环中，而它并非与因子VIII共价相连。 FvW先天缺乏或这一因子的结构缺陷确实引起von Willebrand疾病，该疾病表现 为皮肤和粘膜出血。当需要进行手术时，这一疾病的临床表现非常异类并且问题颇多。急 需对von Willebrand疾病的治疗以矫正原发止血(出血时间)和凝结缺陷。 通常将使用富含FvW的人血浆衍生物(例如该血浆的冷沉淀物级分或含有足量与 之相伴的FvW的因子VIII浓縮物)的替代疗法对该疾病进行治疗。 但是FvW是难于纯化的蛋白质。事实上，Von Willebrand因子是已知的在血浆中 循环的最大蛋白质。其由一组二硫键连接的多聚体构成，该多聚体的基础元件具有分子量 约260千道尔顿(kDa)。血浆中，FvW的最小形式是440至500kDa的二聚体，而最大形式是 分子量可以达到两千万道尔顿的所述二聚体的多聚体。多聚体中亚基的排列可以是对于在其中形成它的细胞特异的FvW在巨核细胞和内皮细胞中合成且聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
从选自（ｉ）含有ＦⅧ和ＦｖＷ的混合物的溶液，（ｉｉ）含有ＦｖＷ的溶液，（ｉｉｉ）源于非人动物的分泌物的溶液，和（ｉｖ）源于含有ＦⅧ的植物提取物的溶液来纯化ＦⅧ或ＦｖＷ的方法，所述方法的特征在于，包括在离子交换色谱过滤型膜上吸附ＦⅧ或ＦｖＷ的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】FR 2007-8-30 0757266从选自(i)含有FVIII和FvW的混合物的溶液，(ii)含有FvW的溶液，(iii)源于非人动物的分泌物的溶液，和(iv)源于含有FVIII的植物提取物的溶液来纯化FVIII或FvW的方法，所述方法的特征在于，包括在离子交换色谱过滤型膜上吸附FVIII或FvW的步骤。2. 根据权利要求l的方法，其中所述过滤型膜为阴离子交换色谱膜。3. 根据权利要求1或2的方法，其中所述过滤型膜为强阴离子交换器。4. 根据前述任一权利要求的方法，其中所述膜带有包括季铵基团的包被。5. 根据前述任一权利要求的方法，其中所述膜为大孔型膜。6. 根据前述任一权利要求的方法，其中所述膜为聚醚砜型膜。7. 根据前述任一权利要求的方法，其中所述溶液含有FVIII和FvW的混合物。8. 根据权利要求7的方法，其中所述溶液为血浆源的。9. 根据权利要求8的方法，其包括下述步骤a) 提供来自血浆的冷沉淀物，b) 在所述离子交换色谱膜上吸附因子VIII和Von Willebrand因子，c) 通过使用具有适当离子强度值的洗脱缓冲液来回收因子VIII或V...

【专利技术属性】
技术研发人员：M普勒，P博内尔，
申请(专利权)人：LFB生物技术公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]