本发明专利技术提供了实现３－吲哚－丙酮酸的节约且便利生产的手段。使用具有限定碱基序列的多核苷酸构建了转化体，该限定碱基序列编码具有氧化酶活性的蛋白质。然后，在培养基中培养此转化体，如此通过在培养基和／或转化体中积累氧化酶而生成氧化酶。另外，在存在上文所述转化体和／或其培养物的条件下将色氨酸转变成３－吲哚－丙酮酸，由此生成３－吲哚丙酮酸。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新的氧化酶基因及利用该基因生产3-吲哚-丙酮酸的新方法。
技术介绍
在Giovanna De Luca等的用于生产3-吲哚-丙酮酸的化学方法中，通过在存在 用于使质子受体脱水的碱的条件下使作为起始材料的色氨酸与吡啶醛反应，以50-62%产 率获得了 3-吲哚-丙酮酸(参见JP Sho-62-501912，国际公开87/00169小 册子)。在此方法中，所需要的碱和吡啶醛价格昂贵，而且产率低。结果， 其生产成本似乎很高。通过使用吲哚和3-溴-2-肟基丙酸乙酯(ethyl-3-bromopyruvate ester oxime)作为原料进行的缩合反应及随后进行的酸水解，Politi Vincenzo等以64%产 率获得了 3-吲哚-丙酮酸(参见欧洲专利申请公开No.421946)。在此方法 中，需要使用硅胶进行的纯化步骤，产率低，原料昂贵，而且工业生产的成本很高。另一方面，作为生产3-吲哚-丙酮酸的酶促方法，使用氨基转移酶进行的方法 是已知的(参加下文反应式1)。(反应式1)氣基转移酶已经报告了如下的一种方法，其中通过容许源自麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)的L-色氨酸(L-Trp)氨基转移酶作用于L-Trp而自40mM L-色氨酸和80mM 2_酮戊二酸生成3-吲哚-丙酮酸，并通过离子交换树脂纯化以实现72%的产率(参见 Bobe Ruediger等，东德专利DD 297190)，还已经报告了如下的一种方法， 其中容许天冬氨酸氨基转移酶作用于L-Trp和2-酮戊二酸以生成3-吲哚-丙酮酸，然 后通过用石油醚萃取反应液和通过柱层析进行的分级进行纯化，并收集级分(参见Mario Materazzi 等，JPSho_59-95894_A)。国际公开 No.2003/091396 小册子和美国专利申请公开No.2005/0282260记载了由源自大肠杆菌 (Escherichia coli)的aspC基因和tyrB基因编码的氨基转移酶。在使用氨基转移酶进行的 这些方法中，产率是低的，需要作为氨基受体的酮酸(如2-酮戊二酸)作为L-Trp之外 的原料，而且以与待产生的3-吲哚-丙酮酸等摩尔的量生成与所存在的氨基受体对应的 一种氨基酸作为副产物。此外，为了提高产率，向反应体系添加相对于L-Trp过量的酮 酸。如此，在反应后剩余未反应的酮酸。由于这些原因，为了自反应液收集目标3-吲 哚-丙酮酸，需要使用离子交换树脂进行的纯化步骤。如此，操作是复杂的，而且成本 是高的。作为自L-Trp生产3-吲哚-丙酮酸的方法，使用L-氨基酸氧化酶的方法也是已知的。然而，在这点上，3-吲哚-丙酮酸被L-氨基酸氧化酶氧化色氨酸(参见下文反 应式2)时作为副产物生成的过氧化氢分解成吲哚乙酸(参见下文反应式3)。如此，产生 了通过向反应体系添加过氧化氢酶来分解过氧化氢(参见下文反应式4)的方法(参见美 国专利No.5,002,963，授予De Luca等，1991)。(反应式2)权利要求1.选自如下(a) (e)的多核苷酸(a)编码具有SEQID NO 2所示氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸；(b)编码具有在SEQID NO: 2所示氨基酸序列中取代、缺失和/或插入一个或数个 氨基酸而得到的氨基酸序列且具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸；(C)编码具有与SEQ ID NO 2所示氨基酸序列有90%或更高的同源性的氨基酸序列 且具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸；(d)具有SEQID NO 1所示核苷酸序列中核苷酸编号第61-1476位的核苷酸序列的 多核苷酸；(e)与SEQID NO 1所示核苷酸序列中核苷酸编号第61-1476位的核苷酸序列的互 补核苷酸序列或与能够由该序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有氧化酶活性 的蛋白质的多核苷酸。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述严格条件是以相当于1XSSC和0.1 % SDS 的盐浓度于60°C进行清洗的条件。3.—种重组多核苷酸，其具有如权利要求1或2所述的多核苷酸。4.一种转化体，其中导入了如权利要求3所述的重组多核苷酸。5.—种生产氧化酶的方法，其特征在于在培养基中培养如权利要求4所述的转化体， 从而在该培养基和/或转化体中积累氧化酶。6.一种生产3-吲哚-丙酮酸的方法，其包括在如权利要求4所述的转化体和/或其 培养物的存在下将色氨酸转变成3-吲哚-丙酮酸的步骤。7.如权利要求6所述的生产3-吲哚-丙酮酸的方法，其中向将色氨酸转变成3-吲 哚_丙酮酸的反应体系中添加超氧化物歧化酶。8.如权利要求6所述的生产3-吲哚-丙酮酸的方法，其中向将色氨酸转变成3-吲 哚_丙酮酸的反应体系中添加表达超氧化物歧化酶的转化体和/或其培养物。9.如权利要求8所述的生产3-吲哚-丙酮酸的方法，其中所述培养物是通过破裂表 达所述超氧化物歧化酶的所述转化体的细胞膜而获得的。全文摘要本专利技术提供了实现3-吲哚-丙酮酸的节约且便利生产的手段。使用具有限定碱基序列的多核苷酸构建了转化体，该限定碱基序列编码具有氧化酶活性的蛋白质。然后，在培养基中培养此转化体，如此通过在培养基和/或转化体中积累氧化酶而生成氧化酶。另外，在存在上文所述转化体和/或其培养物的条件下将色氨酸转变成3-吲哚-丙酮酸，由此生成3-吲哚丙酮酸。文档编号C12N1/21GK102027117SQ20088010414公开日2011年4月20日 申请日期2008年8月15日 优先权日2007年8月24日专利技术者原诚一, 杉山雅一, 横关健三, 渡部乙比古, 田场登志希, 铃木俊一, 高仓康彰 申请人:味之素株式会社本文档来自技高网...
【技术保护点】
选自如下（ａ）～（ｅ）的多核苷酸： （ａ）编码具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸； （ｂ）编码具有在ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示氨基酸序列中取代、缺失和／或插入一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列且具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸； （ｃ）编码具有与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示氨基酸序列有９０％或更高的同源性的氨基酸序列且具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸； （ｄ）具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示核苷酸序列中核苷酸编号第６１－１４７６位的核苷酸序列的多核苷酸； （ｅ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示核苷酸序列中核苷酸编号第６１－１４７６位的核苷酸序列的互补核苷酸序列或与能够由该序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：高仓康彰，原诚一，田场登志希，铃木俊一，杉山雅一，渡部乙比古，横关健三，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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