奶中一种或多种蛋白的提取方法技术

本发明专利技术涉及一种存在于奶中的至少一种蛋白的提取方法，所述蛋白表现出与所述奶中复合的或非复合的钙离子的亲和性，包括如下步骤：ａ）通过将奶与可溶性盐接触产生钙化合物沉淀而释放蛋白，以通过这种方法获得蛋白富集的液相，该可溶性盐的阴离子由于其具有在这种介质中形成所述不溶性钙化合物的能力而被选择；ｂ）将蛋白富集的液相与钙化合物沉淀分离，而且，所述液相被分离成脂相和包含蛋白的水性非脂相；以及ｃ）回收含有蛋白的水性非脂相。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及奶中 一种或多种蛋白的提取方法。所述蛋白对所述奶中复合的 或非复合的钙离子具有亲和性。本专利技术中，复合的或非复合的钙离子指结合到酪蛋白以形成酪蛋白的胶束 胶体结构的磷酸钩盐，或者指这些没有结合到酪蛋白并因此是自由的盐。这些离子也是溶解在奶中的与上述不同的各种4丐盐和/或有机的和/或无机钧复合 物。对奶中钙离子具有亲和性的蛋白是指那些自然存在的蛋白，例如乳清蛋白、 乳球蛋白以及免疫球蛋白。这些蛋白也指存在于转基因动物奶中的重组蛋白，例如，血凝因子，尤其是因子vn、因子vhi和因子ix。
技术介绍
市售药物的主要部分对应于合成获得的化学物质。事实上，直到最近，现 代医学高度依赖于利用化学合成生产的药物，用于疾病的诊断和治疗。然而，蛋白代表携带生物信息的分子的实质部分，尤其是大量的激素、生 长因子、血凝因子或抗体。通常，蛋白质为基于氨基酸的聚合物，且大部分具有高分子量，其不能通 过化学合成在可接受的成本下获得。这些用于治疗的蛋白质通常从人类或者动 物组织或血液，例如活体，通过分离和纯化获得。尤其是从猪胰腺提取的胰岛 素、从血浆中提取的例如为因子vin或因子ix的血凝因子、或者免疫球蛋白。尽管目前上述蛋白质的制备方法被大量应用，然而，它们具有缺陷。从血 小板中提取的一些蛋白，例如为促红细胞生成素，的低含量使得它们不能足够 量的分离以满足不断增长的治疗需要。此外，在血浆蛋白的生产过程中，人体 内病毒、朊病毒或者其他致病剂的存在需要添加病毒灭活和/或病毒消除的包涵 体，以获得可用于治疗的有用产品。为了克服这些缺陷，遗传工程被使用。该技术同样大量应用于合成蛋白中，5从一个独立基因转移到负责分泌期望蛋白的细胞。从源细胞系统外获得的这样 的蛋白称之为《重组》。才艮据这一技术，可以使用不同细胞系统。细菌系统，例如E. coli,大量应用且有效。它们能低成本的生产重组蛋白。 然而，这些系统不能用于生产简单的非糖基化蛋白，其不需要精细折叠处理。真菌系统同样应用于分泌蛋白的生产。这些真菌系统的缺陷在于它们是翻 译后修饰的起因，包括，例如，接枝聚糖部分和疏酸基，其能高度影响生产的 蛋白的药代动力学，尤其是添加甘露糖衍生物的不同基团。使用杆状病毒的系统可以生产非常不同的蛋白，例如疫苗蛋白或生长激素， 但是它们工业化应用不是最优的。同样使用哺乳动物培养物以用于重组复合蛋白的生产，例如单克隆抗体。 细胞表达系统导致正确的折叠的和修饰的重组蛋白。与生产成本相比，低的产 量是其主要缺陷。这些细胞系统的变体包括实现转基因植物以用于获得大量的蛋白。然而， 这些系统产生植物-特异性翻译后修饰，尤其是在生产的蛋白中添加了高度致免 疫木糖残基，因此限制了它们在治疗应用中的用途。前面提到的细胞系统的替代包括使用转基因动物以用于生产重组疫苗或者 复合治疗蛋白。因此，获得的蛋白表现出与人类接近的糖基化，且能^皮正确的 折叠。这些复合蛋白并不仅由一个简单的例如为生长激素的多肽链组成，它们 组装成氨基酸后用不同的途径被修饰，尤其是通过特异性断裂、糖基化和羧甲 基化。大部分情况下，通过细菌细胞或酵母不能实现修饰。另一方面，转基因 动物能同时结合细菌细胞系统中遇到的表达水平以及细胞培养物中获得的翻译 后修饰，同时与使用细胞表达系统相比，降低了制造成本。来自于转基因动物的生物材料中，奶是研究的目标，其被考虑为非常符合 要求的分泌重组蛋白的来源。从转基因动物的奶中生产的重组蛋白，能很容易的通过将编码所感兴趣蛋 白的基因接枝到一个负责合成奶蛋白的基因的调控区而获得，其会指导特别是 在乳腺中的合成，之后分泌到奶中。例如，EP0527063描述了在转基因哺乳动物的奶中感兴趣蛋白的生产。提到了通过抗乳血清的启动子来控制编码感兴趣蛋白的基因的表达。另外的专利申请或者专利描述了抗体(EP 0741515 )、胶原(WO 96/03051 )、 人类因子IX( US 6046380 )、以及因子VIII/血管性血友病因子复合物(EP 0807170) 在转基因哺乳动物的奶中的制备。尽管这些方法在蛋白表达方面有满意的结果，但是使用奶作为重组蛋白的 源具有缺陷。主要缺陷一方面在于难以从奶中提取获得满意的产量，另一方面 在于接下来难以提纯。事实上，奶是一种混合物，90%由含有不同成分的水组成，该成分能分为 三类。第一类称为抗乳血清(或乳清)，由糖类、可溶蛋白、矿物质和水溶性维 生素组成。第二类称为脂相(或乳膏)，含有乳化形式的脂肪。第三类称之为蛋 白相，包含80%的酪蛋白，其在钙的存在下，在pH4.6或者凝乳酶、^f^凝剂 的作用下形成全部的可沉淀蛋白。不同的酪蛋白与磷酸4丐盐能形成直径达到 0.5pm胶体胶束复合物，磷酸钙盐例如为磷酸三钩盐的聚合《团簇》形式，即 Ca9(P04)6。这些胶粒是由酪蛋白亚基形成的，酪蛋白亚基包含包围着疏水核 的富含酪蛋白-K的亲水层，磷酸钩盐通过静电作用与亲水层结合。这些磷酸盐 也可存在于胶粒的内部空间中，不与酪蛋白结合。这种蛋白相也包含可溶性蛋 白，例如乳清蛋白和乳球蛋白，以及来自于血液的白蛋白和免疫球蛋白。依赖于分泌到转基因动物奶中的重组蛋白的性质，其可以存在于抗乳血清 或者蛋白相中，甚至是同时存在于上述两者中。每个奶成分的含量和复杂度使 得提耳又蛋白变的更为困难，尤其是当其圏闭到酪蛋白月交束中。另外的困难在于 蛋白存在于两种相中的 一个具有不可预见性。重组蛋白还能与奶中以盐和/或不同可溶性复合物、或者酪蛋白胶束的磷酸 钙盐的形式存在的4丐离子表现出亲合性。这一亲合性通过蛋白与二价钩离子的 静电连接表现出来。亲合性蛋白/钩离子可以定义亲合常数，利用该值规定连接 强度。通常来说，大部分与钙离子表现出亲合性的蛋白与胶束的磷酸钓盐相结 合。其的提取需要执行复合步骤，带来了实现和产量的问题。乳品加工业的经典溶剂不能用于这种情况，该经典溶剂用于蛋白的分离， 该分离由巴氏灭菌、接着再酶促凝或者酸促凝(pH4.6)组成。这是由于在温度 和pH联合作用下，重组蛋白常常被变性。此外，蛋白在酪蛋白胶束中的圈闭导致了低的提取产量。另外用在通过过滤、离心和/或沉淀或析出技术来对奶进 行分离的物理方法中的溶剂也导致不能接受的才是取产量，且提取出的重组蛋白纯度低。 —EP 0264166描述了在遗传学转基因动物的奶中期望蛋白的分泌。该文献中 没有提及这种蛋白从奶中的纯化步骤。US 4519945描述了 一种用于提取重组蛋白的方法，该方法通过从奶中制备 酪蛋白的沉淀物，再进行如前所述的酸化和加热步骤。该方法显著降低了期望 蛋白的活性并且提取产量低。US 6984772公开了从转基因哺乳动物的奶中纯化重组纤维蛋白原的方法。 该方法包括通过连续离心从酪蛋白球中分离抗乳血清，以及蛋白相的分离。抗 乳血清被分离并被储存用于接下来的处理，获得了一种纤维蛋白原的纯化溶液。然而，该方法不能用于生产产量满意的圈闭到酪蛋白胶束内和/或上的重组 蛋白。例如血;疑因子，例如因子VII、因子VI1I和因子IX。专利申请WO 2004/076695描述了从转基因动物的奶中重组蛋白的过滤方 法。该方法包括第一步奶的净化，该步骤即利用一种方法除去奶的成分以获得 一种易于过滤通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
提取存在于奶中的至少一种蛋白的方法，所述蛋白表现出与所述奶中复合的或非复合的钙离子的亲和性，包括如下步骤：　ａ）通过将奶与可溶性盐接触产生钙化合物沉淀而释放蛋白，以通过这种方法获得蛋白富集的液相，该可溶性盐的阴离子选择具有在这种介质中 形成所述不溶性钙化合物的能力的阴离子；　ｂ）将蛋白富集的液相与钙化合物沉淀分离，而且，所述液相被分离成脂相和包含蛋白的水性非脂相；以及　ｃ）回收含有蛋白的水性非脂相。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿兰勒雅尔，米歇尔诺格雷，米歇尔泰利耶，
申请(专利权)人：LFB生物科技公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]