一种灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，属于中药及其制品和功能食品原料及其制品的指纹图谱技术领域。本发明专利技术包括灵芝孢子粉多糖的提取、灵芝多糖的部分水解、灵芝多糖部分水解产物的ＰＭＰ衍生化反应、反相ＨＰＬＣ指纹分析及其标准指纹图谱的确定。通过对１５个不同产地的灵芝孢子粉样品的多糖成分的ＨＰＬＣ分析及其指纹图谱的比较，确定了其共有指纹特征，得到标准指纹图谱。指纹图谱中共有峰１９个，共有峰峰面积之和占总峰面积的９８％，峰面积超过总峰面积５％的指纹峰４个。本方法稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握灵芝孢子粉多糖质量情况及产地来源，为灵芝孢子粉的质量控制和真伪鉴别提供了一种新的科学方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种灵芝孢子粉多糖的HPLC指纹图谱的建立方法，本专利技术还涉及 由此方法所得到的灵芝孢子粉多糖标准指纹图谱。属于中药及其制品和功能食品原料及 其制品的指纹图谱
技术介绍
灵芝是属于真菌门，担子菌纲，多孔菌科，灵芝科，灵芝属的真菌。我国药典 规定可入药的灵芝有赤芝和紫芝 QGanoderma sinemeZhao，XuetZhang^ ；国家食品药品监督管理局公布的可用于保健食品的灵芝品 禾中有赤芝、紫芝禾口松衫灵芝(.Ganodeima tsugae Murr)。灵芝孢子(Ganodeima Iucidum spore)是灵芝(一般为赤芝)成熟期从菌盖弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞，生物 学上称孢子，集中起来后呈粉末状，通称灵芝孢子粉。灵芝孢子具有免疫调节、抗肿 瘤、调节血脂、降血糖等多种生理功效，故在近年来其市场甚为火热。但因缺乏科学全 面的检测方法和质量标准，灵芝孢子粉及其加工产品的质量良莠不齐，难以有效控制和 鉴别。目前已有灵芝孢子脂溶性成分指纹图谱分析方法的专利，但尚无水溶性成分的指 纹图谱分析方法的报道。已有的灵芝粗多糖含量的测定方法不能表征和鉴别灵芝孢子粉 样品中多糖的实际质量优劣。为此，本专利技术首次针对灵芝孢子粉的主要功效成分多糖类 物质，采用超声波辅助热水浸提-部分酸水解-PMP柱前衍生反相HPLC法，对不同灵芝 孢子粉样品中多糖进行分析表征和比较，确定共有特征峰，利用色谱指纹图谱专用软件 建立灵芝孢子粉多糖的标准指纹图谱。本专利技术可为我国灵芝孢子粉的质量检测方法和质 量标准的提升及完善提供科学依据与参考，从而促进我国灵芝孢子粉类产品的质量提高 和稳定，更好地规范灵芝市场，维护消费者权益，造福于国人的身体健康。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法，借此可将灵芝 孢子粉多糖指纹图谱作为灵芝孢子粉类产品的质量控制和真伪鉴别的主要指标之一。本 专利技术还同时提供了灵芝孢子粉多糖的标准指纹图谱。本专利技术的技术方案灵芝孢子粉多糖指纹图谱的建立方法包括下列步骤1.灵芝孢子粉多糖的提取对于破壁灵芝孢子粉样品，采用下述方法(1)；对于未 破壁灵芝孢子粉，采用下述方法(2)。(1)准确称取破壁灵芝孢子粉样品0.5 l.Og于50mL离心管中，加入30mL超纯 水，于水浴60 80°C超声30 60min(功率300瓦)，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗 涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析12小时， 50 60°C真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至5mL作为粗多糖水溶液，待测。或(2)准确称取未破壁灵芝孢子粉样品0.5 l.Og于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于90 95°C水浴振荡恒温浸提2 3小时，再于水浴60 80°C超声30 60min (功率 300瓦)，以下操作同(1)。2、灵芝孢子粉多糖部分酸水解吸取100 μ L所得的粗多糖水溶液于5mL的具 塞刻度试管中，加入10(^1^的0.511101/]^三氟乙酸(TFA)，充风封管，100°C水解Ih; 冷却后打开盖，真空干燥或用N2吹干，以去除TFA，再加200 μ L超纯水溶解残渣(水解 产物)，备用。3、灵芝孢子粉多糖部分酸水解产物的PMP衍生化反应操作取部分水解后的 超纯水溶解的水解产物(或混合单糖标液)100 μ L,加100 μ L 0.6Μ的NaOH溶液，混 勻。取其混合液50yL于5mL具塞试管中，再加50 μ L 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩 涡混勻，同样在70°C的烘箱中反应30 100 min,取出放置IOmin冷却至室温；力卩60 μ L 0.3mol/L的HCl中和，加超纯水至lmL，再加等体积ImL的氯仿，振摇，静置，弃去氯 仿相，重复萃取共3次。将水相用0.45 μ m微孔膜过滤后供HPLC进样分析。4、PMP衍生化产物的反相高效液相色谱分析其条件为色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18, 250mmX4.6 mm i.d., 5 μ m ；流动相0.1 mol/L 磷酸盐(pH 6.7)缓冲 液-乙腈(体积比为78 83 22 17)；柱温20 35°C;检测波长245 254 nm ；流速 0.8-1 mL /min ；进样体积10 50 μ L。在此条件下分别进样分析单糖混合标样及样品的 PMP衍生化产物，得到混合标样的色谱图和灵芝孢子粉多糖的色谱指纹图谱。以葡萄糖 峰为参照，计算标样和样品中各峰的相对保留时间；根据标样和样品的相对保留时间对 照定性灵芝孢子多糖样品的相关色谱峰；并以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对 峰面积。5、标准指纹图谱的建立通过对15个不同产地的灵芝孢子粉样品中多糖成分 水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱图进行比较，确定共有特征峰，并将色谱数据导 入指纹图谱专用软件得到由其共有特征峰构成的灵芝孢子粉多糖的标准色谱指纹图谱。 待测样品指纹图谱可与标准指纹图谱对比，区别其异同。共有特征峰有19个，它们的相对保留时间RT(以葡萄糖峰为参照)的相对标准 偏差RSD均小于2 % ；即1号峰平均RT为0.468， 2号峰平均RT为0.490， 3号峰平均RT为0.508， 4号峰平均RT为0.523， 5号峰平均RT为0.544， 6号峰平均RT为0.577， 7号峰平均RT为0.603， 8号峰平均RT为0.647， 9号峰平均RT为0.669， 10号峰平均RT为0.725，RSD 为 0.40% RSD 为 0.10% RSD 为 0.31% RSD 为 0.23% RSD 为 0.10% RSD 为 0.12% RSD 为 1.05% RSD 为 0.77% RSD 为 0.10% RSD 为 0.19% 11号峰平均RT为0.774，RSD为0.08% 12号峰平均RT为0.842，RSD为0.07% 13号峰平均RT为0.876，RSD为0.21%14 号峰平均 RT 为 0.912，RSD 为 0.08% ； 15号峰平均RT为1.000，RSD为0 ； 16号峰平均RT为1.131，RSD为0.06% 17号峰平均RT为1.215，RSD为0.09% 18号峰平均RT为1.256，RSD为0.09% 19号峰平均RT为1.482，RSD为0.07% 其中超过总峰面积5%的指纹峰有4个，分别为2号峰甘露糖，相对峰面积 5.12% 9.11%; 15号峰葡萄糖，相对峰面积20.94% 48.47% ； 16号峰半乳糖，相对峰面 积10.38% 54.41% ； 19号峰岩藻糖，相对峰面积5.19% 14.31%。灵芝孢子粉多糖的标准指纹图谱如图3所示。2号峰、7号峰、8号峰、10号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰分别为甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半 乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖；这些糖均依据与灵芝孢子粉样品分析同样的色谱条件 下测定的单糖混合标准溶液的PMP衍生物的保留时间对照定性；单糖混合标准溶液的 PMP衍生化反应操作同上所述，将“取部分水解后超纯水溶解的水解产物”，改为“取单 糖混合标准溶液”，该单糖本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法，其特征在于包括灵芝孢子粉多糖的提取、灵芝孢子粉多糖的部分水解、灵芝孢子粉多糖部分水解产物的１－苯基－３－甲基－５－吡唑琳酮ＰＭＰ衍生化反应、反相高效液相色谱的指纹分析及其标准指纹图谱的确定；步骤为：（１）灵芝孢子粉多糖的提取：（ａ）对于破壁灵芝孢子粉：准确称取破壁灵芝孢子粉样品０．５～１．０ｇ于５０ｍＬ离心管中，加入３０ｍＬ超纯水，于水浴６０～８０℃功率３００瓦超声３０～６０ｍｉｎ，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析１２小时，５０～６０℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至５ｍＬ作为粗多糖水溶液，待测；或（ｂ） 对于未破壁灵芝孢子粉：准确称取未破壁灵芝孢子粉样品０．５～１．０ｇ于５０ｍＬ离心管中，加入３０ｍＬ超纯水，于９０～９５℃水浴振荡恒温浸提２～３小时，再于水浴６０～８０℃功率３００瓦超声３０～６０ｍｉｎ，以下操作同（ａ）；（２）灵芝孢子粉多糖的部分水解：吸取１００μＬ步骤（１）所得的粗多糖水溶液于５ｍＬ的具塞刻度试管中，加入１００μＬ 的０．５ｍｏｌ／Ｌ 三氟乙酸ＴＦＡ，充Ｎ↓［２］封管，１００℃水解１ ｈ；冷却后打开盖，真空干燥或用Ｎ↓［２］吹干，以去除ＴＦＡ，再加２００μＬ超纯水溶解水解产物，备用；（３）灵芝孢子粉多糖部分水解产物的ＰＭＰ衍生化反应：取步骤（２）部分水解后超纯水溶解的水解产物１００μＬ，加１００μＬ ０．６Ｍ ＮａＯＨ溶液，混匀；取其混合液５０μＬ于５ｍＬ具塞试管中，再加等体积５０μＬ的０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＰＭＰ甲醇溶液，漩涡混匀，在７０℃的烘箱中反应３０～１００ｍｉｎ，取出放置１０ｍｉｎ冷却至室温；加６０μＬ ０．３ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ中和，加超纯水至１ｍＬ，再加等体积１ｍＬ的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，重复萃取共３次；将水相用０．４５μｍ微孔膜过滤后供ＨＰＬＣ进样分析；（４）反相高效液相色谱的指纹分析：反相高效液相色谱分析条件为：色谱柱：ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８，２５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．，５μｍ；流动相：ｐＨ６．７的０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液－乙腈，磷酸盐缓冲液∶乙腈体积比为７８～８３∶２２～１７；柱温：２０～３５℃；检测波长：２４５～２５４ｎｍ；流速：０．８～１ｍＬ／ｍｉｎ；进样体积：１０～５０μＬ；在此条件下进样分析步骤（３）过滤后的ＰＭＰ衍生化产物，得到灵芝孢子粉多糖的高效液相色谱指纹图谱；（５）标准指纹图谱的确定：通过１５个不同产地的灵芝孢子粉样品中的多糖水解产物的ＰＭＰ衍生物的高效液相色谱测定，比较其色谱图，确定共有特征峰为 １９个；所述的１９个共有特征峰以葡萄糖峰为参照的相对保留时间ＲＴ的相对标准偏差ＲＳＤ均小于２％；即：１号峰平均ＲＴ为０．４６８，ＲＳＤ为０．４０％；２号峰平均ＲＴ为０．４９０，ＲＳＤ为０．１０％；３号峰平均ＲＴ为０．５０８，ＲＳＤ为０．３１％；４号峰平均ＲＴ为０．５２３，ＲＳＤ为０．２３％；５号峰平均ＲＴ为０．５４４，ＲＳＤ为０．１０％；６号峰平均ＲＴ为０．５７７，ＲＳＤ为０．１２％；７号峰平均ＲＴ为０．６０３，ＲＳＤ为１．０５％；８号峰平均ＲＴ为０．６４７，ＲＳＤ为０．７７％；９号峰平均ＲＴ为０．６６９，ＲＳＤ为０．１０％；１０号峰平均ＲＴ为０．７２５，ＲＳＤ为０．１９％；１１号峰平均ＲＴ为０．７７４，ＲＳＤ为０．０８％；１２号峰平均ＲＴ为０．８４２，ＲＳＤ为０．０７％；１３号峰平均ＲＴ为０．８７６，ＲＳＤ为０．２１％；１４号峰平均ＲＴ为０．９１２，ＲＳＤ为０．０８％；１５号峰平均ＲＴ为１．０００，ＲＳＤ为０；１６号峰平均ＲＴ为１．１３１，ＲＳＤ为０．０６％；１７号峰平均ＲＴ为１．２１５，ＲＳＤ为０．０９％；１８号峰平均ＲＴ为１．２５６，ＲＳＤ为０．０９％；１９号峰平均ＲＴ为１．４８２，ＲＳＤ为０．０７％；其中超过总峰面积５％的指纹峰有４个，分别为：２号峰甘露糖，相对峰面积５．１２％～９．１１％；１５号峰葡萄糖，相对峰面积２０．９４％～４８．４７％；１６号峰半乳糖，相对峰面积１０．３８％～５４．４１％；１９号峰岩藻糖，相对峰面积５．１９％～１４．３１％。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：戴军，陈尚卫，朱松，王浩豪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32
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