重组金黄色葡萄球菌肠毒素Ｍ及应用制造技术

一种重组金黄色葡萄球菌肠毒素Ｍ，该蛋白属于一种超抗原，具有ＳＥＱ　ＩＤＮＯ．１的氨基酸序列，是利用来源于金黄色葡萄球菌的编码ＳＥＭ的基因与一种质粒载体重组，并将其转化至合适宿主进行表达，通过亲和纯化获得。本发明专利技术利用体外小鼠脾淋巴细胞增殖实验和肿瘤细胞抑制实验证实该重组蛋白具有典型的超抗原活性，且较ＳＥＣ更强，可在制备刺激淋巴细胞增殖、抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用。适用于高效制备具有超抗原活性的高纯度肠毒素以及超抗原制剂的开发。本发明专利技术设计合理，对重组ＳＥＭ进行高效表达，表达强度占全菌蛋白的１５－２５％左右，且为可溶性表达，便于后续分离纯化；采用亲和层析对目的蛋白进行纯化，步骤简单，纯化速度快。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物工程，涉及一种重组金黄色葡萄球菌肠毒素MGtaphylococcal Enterotoxin M，SEM)的制备以及在制备用于刺激淋巴细胞增殖、抑制肿瘤细胞生长的药物 中的用途。
技术介绍
1989年，超抗原的概念由瑞典科学家White提出，它是一类由细菌、病毒、寄生虫 产生的对淋巴细胞有强大刺激功能的蛋白质，由于其对T淋巴细胞的激活能力是普通抗原 的2000-50000倍，故称为超抗原。金黄色葡萄球菌肠毒素Staphylococcal Enterotoxin, SE)是目前全世界范围内广泛研究的一种超抗原。其中研究最为深入的主要包括A型金 黄色葡萄球菌肠毒素GtaphylococcalEnterotoxin A, SEA)、B型金黄色葡萄球菌肠毒 素(Staphylococcal EnterotoxinB, SEB)、C2 型金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal Enterotoxin C2, SEC2)等。与普通抗原不同，肠毒素超抗原首先以完整分子结合于抗原提呈细胞(APC)表面 的II类主要组织相容性复合体(MHC)的抗原结合沟槽外侧，而后与T细胞表面的抗原受体 分子(TCR)的Vi3区结合，形成SE-MHC-TCR三分子复合物后大量激活T细胞。由此激活 的T细胞可直接杀伤表达MHC-II类分子的肿瘤细胞，而对不表达MHC-II类分子的肿瘤细 胞也可产生间接的杀伤效应。同时，被SE激活的⑶4+Τ细胞可分泌大量细胞因子，如IL-2、 IFN-y ,TNF-α等，对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用。IL_2等因子亦可激活NK细胞，使其发挥 自然杀伤作用，IFN-Y、TNF-a等细胞因子还可促进肿瘤细胞的MHC-II类分子的表达，增 强T细胞的识别。因此，经SE激活的T细胞能对肿瘤细胞和肿瘤组织产生高效的直接或者 间接的杀伤作用。如Perabo等人证实经SEB刺激的外周血单核细胞(PBMC)能高效诱导人 膀胱癌细胞株RT112细胞和RT4细胞调亡。Hedlund等人进行的体内实验表明，SEA激活T 细胞使之增殖作用在每只小鼠0. I-IOOyg范围内呈剂量依赖关系，注射后1天出现最大效 应，增殖效应维持4天。为提高在肿瘤治疗中的靶向性和特异性，人们针对不同肿瘤细胞表 面特异性抗原，制备了多种相关抗原的单抗-超抗原融合蛋白或将单抗与超抗原偶联，大 大增强了所激活的T细胞对肿瘤细胞和肿瘤组织的靶向性，使其能特异地杀伤肿瘤细胞， 抑制肿瘤生长。此外，人们还利用肿瘤细胞表面过度表达的受体的配体制备了配体-超抗 原融合蛋白，有效地提高了由此激活的T细胞对肿瘤组织的靶向性。另外，将超抗原基因转 染肿瘤细胞，将超抗原修饰的肿瘤细胞作为瘤苗继而免疫动物，亦获得了令人满意的抵抗 肿瘤细胞再次攻击的效果。在我国，以金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)为主要有效成分的金黄色葡萄球菌滤 液制剂作为肿瘤防化疗治疗的辅助药物应用于临床已有近十个年头，大量的临床数据证明使用后肿瘤患者的免疫能力获得了显著的提高，患者的食欲、睡眠以及全身状况均得到了 明显好转。如罗锋等对35例浅表转移性肿瘤应用金葡菌滤液制剂进行局部治疗，治疗一个 月后总有效率达82.9%。汤炜等通过对早期口腔癌采用局部金葡菌滤液制剂治疗及对晚期 口腔癌应用金葡菌滤液制剂联合化疗，发现其可使大量淋巴细胞及纤维组织聚集在癌巢附 近，并能观察到肿瘤细胞显著减少甚至部分病例肿瘤细胞消失。吴洁等将金葡菌滤液制剂 作为化疗的辅助药物应用于食管癌治疗，结果显示与对照组相比，可明显升高白细胞，减轻 胃肠道反应。尽管目前以SEC为主要有效成分的金葡菌滤液制剂已取得广泛的应用，但由于制 剂中存在着大量的蛋白质以及多肽类杂质，而主要有效成分肠毒素相对含量极低，使得一 部分肿瘤患者在该制剂临床使用过程中出现了一定程度的相似副反应。如，李洪等报道了 分别有和的肿瘤患者在使用金葡菌滤液制剂并联合卡钼治疗恶性胸腔积液过程 中出现了发热和局部疼痛等副反应。刘秀英等在对鼻咽癌患者使用金葡菌滤液制剂联合放 疗治疗的过程中观察到的主要副作用为中、低度发热，约占治疗组患者总数的5%。黎佳全 等也报导了患者在应用金葡菌滤液制剂联合顺钼治疗恶性胸水过程中出现的主要副作用 为发热，约占治疗组患者总数的65. 5%。虽然这些副反应基本是暂时性的，症状可以自行缓 解或者通过对症治疗进行消除，但仍然对肿瘤患者的治疗和康复造成了不良的影响。因此， 对于目前金葡菌滤液制剂在临床应用中遇到的问题，需要制备高纯度的肠毒素并建立严格 可控的质量标准逐步克服解决，以求减少在使用过程中产生的毒副作用并增强其肿瘤抑制 疗效。目前，已经有人利用基因工程手段制备金黄色葡萄球菌肠毒素超抗原，如姜永强等将 SEA、SEB、SECl基因片段克隆至pBV220，在大肠杆菌中经热激诱导获得表达，但这些方法中 纯化步骤均采用了离子交换的方法，存在吸附选择特异性差等弱点。徐明恺等将SEC2基因 克隆至pET48a中表达，但表达的重组产物比天然蛋白增加36个氨基酸，因此抗原决定簇 及产物活性改变的可能性均较大。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种利用基因工程手段制备获得的重组金黄色葡萄球 菌肠毒素M (Staphylococcal Enterotoxin Μ, SEM)，该蛋白属于一种超抗原，具有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列。本专利技术利用其超抗原活性应用于体外促脾淋巴细胞增殖和以及体外抑 制肿瘤细胞生长，并与金黄色葡萄球菌肠毒素CGtaphylococcal Enterotoxin C，SEC)进 行超抗原活性比较。本专利技术的另一个目的是提供重组金黄色葡萄球菌肠毒素M(SEM)的制备方法，本 专利技术构建一种可用于表达金黄色葡萄球菌肠毒素M的重组质粒，该质粒由PGEX-4T-1和SEQ ID NO. 2的核苷酸序列经过重组构建而成，质粒见说明书附图4。本专利技术方法具体通过以下步骤实现(1)设计一对分别带有BamH I和Bio I酶切位点的上下游引物SEQ IDN0. 4 5'-caR Rat cct ttt get att cgc aaa ate ata tcg ca_3'(上游弓丨物，划线部分为BamH I 酶切位点)，SEQ ID NO. 5 5' -gcc_tcg_agt caa ctt tcg tcc tta taa gat att tct ac-3’(下游引物，划线部分为Β ο I酶切位点)，以金黄色葡萄球菌(FRI 1230)基因组为 模板，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得编码SEM蛋白的基因片段，利用T-A克隆将其连入至pGEM-T质粒载体上的多克隆位点，成功构建pGEM-T-SEM重组质粒。通过测序证实获 得的编码SEM蛋白的基因片段序列(见SEQ ID NO. 2)与SignalP 3. (Server预测的SEM 成熟肽蛋白质的基因序列(见SEQ ID NO. 3)相比，仅在N端多出2个氨基酸残基。(2)将上述步骤中得到的含内切酶位点的编码SEM蛋白成熟肽的基因片段用 相应内切酶切割后与用相同内切酶处理后的PGEX-4T-1质粒相连接，成功构建表达质粒 PGEX-4T-1-SEM。(3)将pGEX本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组金黄色葡萄球菌肠毒素Ｍ，该蛋白为一种超抗原，氨基酸序列是ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈枢青，潘映秋，丁丁，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]