一种洋葱愈伤组织诱导方法及其专用培养基技术

本发明专利技术属于植物组织培养领域，公开了一种洋葱愈伤组织诱导方法及其专用培养基。一种洋葱愈伤组织诱导方法，包括选取洋葱外植体，采用添加２，４－Ｄ、６－ＢＡ的Ｂ５培养基进行愈伤组织的诱导培养；所述的Ｂ５培养基中蔗糖浓度为３０ｇ／Ｌ，琼脂浓度为８ｇ／Ｌ，培养基ｐＨ值为５．８，添加的２，４－Ｄ浓度为０．５～２．０ｍｇ／Ｌ，６－ＢＡ浓度为１．０～４．０ｍｇ／Ｌ。本发明专利技术所选取的外植体具有消毒灭菌方法简单方便，接种后污染率低；愈伤组织诱导率高的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物组织培养领域，涉及一种洋葱愈伤组织诱导方法及其专用培养基。
技术介绍
洋葱属于百合科(Liliaceae)葱属，是世界范围内普遍栽培的重要蔬菜之一，它 以肉质鳞片和鳞芽构成产品器官，营养含量丰富，是重要的营养保健型蔬菜。近年来，我国 洋葱栽培面积迅速扩大，洋葱及其加工制品已出口至欧美、日本及东南亚许多国家。但是目 前我国洋葱生产上使用的品种大多为国外品种，国内洋葱品种较少，造成这一情况的原因 是洋葱为二年生草本植物，花器结构小，自交后易发生退化，育种上存在育种周期长，育种 率低等问题。然而利用组织培养技术，可以提高育种效率。洋葱组织培养所用起始材料种类很多，茎尖、鳞茎盘、叶片、鳞片、花器官等取材。 Fridberg曾用附加NAA和KT的MS培养基从洋葱鳞片直接诱异成芽。姜璐琰等(2003)用 洋葱花蕾作为外植体，经过愈伤组织及体细胞胚途径，获得了较高频率的再生植株，其愈伤 最高诱导率为68. 71%。自1983年第一个转基因植物问世以来，植物基因工程技术的发展突飞猛进。烟 草、番茄、辣椒等作物转基因方面已有大量的文献报道，一些转基因作物已在生产上应用。 洋葱转基因体系已有报道，Eady等(1998)以未成熟胚为外植体，建立了高频的再生体系， 最高诱导频率为60%，并建立了以根癌农杆菌为介导，以gfp和npt II为标记基因的转化 体系，获得了转基因再生植株。但目前仍未见实际应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种洋葱愈伤组织诱导方法，本 专利技术的另一目的是提供该方法专用培养基。本专利技术的目的可以通过如下技术方案实现一种洋葱愈伤组织诱导方法，包括选取洋葱外植体，采用添加2，4-D、6_BA的B5培 养基进行愈伤组织的诱导培养；所述的B5培养基中蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为8g/L，pH 值为5. 8，添加的2,4-D浓度为0. 5 2. 0mg/L，6_BA浓度为1. 0 4. Omg/L。其中，所述的外植体选自洋葱幼嫩花序或者洋葱总苞被未开裂的花序中的幼蕾。所述的外植体优选洋葱直径约0. 8-1. 2cm的幼嫩花序。所述的外植体优选洋葱总苞被未开裂的直径为1. 5-2. Ocm的花序中的幼蕾。选择所述的洋葱总苞被未开裂的直径为1. 5-2. Ocm的花序中的幼蕾作为外植体 时，培养基的组成为所述的B5培养基+1. Omg/L 2,4-D+l. Omg/L 6-BA。该诱导方法还包括培养前处理先将花序消毒灭菌，然后撕去总苞被，分别取外植 体，消毒灭菌。所述的消毒灭菌方法为首先用自来水冲洗0.5h，流水冲洗，再用70%的酒精消毒3lmin，然后用0. 的升汞消毒lOmin，最后用无菌水漂洗3 5次。所述的培养条件为温度为25 士 1 °C，光照时间为16h. cf1，光照强度为 50 μ mol · πΓ2 · s-1。以蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为8g/L，pH值为5. 8的B5培养基为基础培养基， 添加 0. 5 2. Omg/L 2，4-D，1. O 4. Omg/L 6-BA。所述的培养基组成为以蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为8g/L，pH值为5. 8的B5培 养基为基础培养基，添加1. Omg/L 2，4-D及1. Omg/L 6-BA。有益效果本专利技术利用不同生长时期的洋葱花蕾为外植体，对影响愈伤组织发生的因素进行 研究，从而建立了一种洋葱愈伤组织诱导方法，利用该方法诱导洋葱愈伤组织，外植体的愈 伤诱导率最高可达为100%。本专利技术通过外植体的选择、培养基的优化，提供了一种专用 于洋葱愈伤组织诱导的外植体和培养基，该组合能显著提高愈伤组织的诱导率。本专利技术诱 导方法提高了洋葱幼蕾愈伤组织的诱导率，为外源基因的转化和多倍体离体诱导奠定了基 石出。本专利技术所选取的外植体具有消毒灭菌方法简单方便，接种后污染率低；愈伤组织 诱导率高的优点。附图说明图1、外植体A培养8周后愈伤组织诱导图片。图2、外植体B、C接种时幼蕾图片。图3、外植体B培养8周时愈伤组织诱导图片，右上角为放大图。图4、外植体C培养8周时愈伤组织诱导图片，右上角为放大图。具体实施例方式实施例11. 1无菌材料的获得实验所用洋葱材料取自南京农业大学园艺学院实验基地，品种为“9866”。采用直 径约0. 8-1. 2cm的幼嫩花序，撕去总苞被后，连同花序轴将其分切成6-8个小块为外植体， 编号A ；采用直径约1. 5-2. Ocm的总苞被未开裂的花序，取其留有短柄(0. 1-0. 3cm)的幼蕾 为外植体，编号B ；采用总苞被已开裂的直径约3. Ocm的花序，取其留有短柄(0. 1-0. 3cm) 的幼蕾为外植体，编号C。先将花序消毒灭菌，然后撕去总苞被，分别取外植体A和B。取留有短柄的幼蕾， 消毒灭菌得到外植体C。消毒灭菌首先用自来水冲洗0.5h，漂去杂质，用70%的酒精消毒 lmin，然后用0. 的升汞消毒lOmin，再用无菌水漂洗3 5遍。将获得的无菌材料外植 体A、B、C接种到培养基上。1. 2培养基B5为基本培养基，其中蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为8g/L，pH值为5. 8。2，4_D 所设浓度梯度为0. 5,1. 0,2. Omg/L，6-BA所设浓度梯度为1. 0,2. 0,4. Omg/L，采用正交试验 设计。将外植体A、B、C分别接种到9cm的玻璃培养皿(或玻璃瓶)中，每个皿接种外植体A4个，外植体B和C各20个，外植体B、C接种时幼蕾图片见图2，每处理3个培养皿，3次 重复。接种后置于培养室中培养，每隔4周继代培养一次。表1愈伤组织诱导的试验设计处理2,4-D6-BA(mg/L)(mg/L)10.51.020.52.030.54.041.01.051.02.061.04.072.01.082.02.092.04.01. 3培养条件将接种后的培养皿或玻璃瓶置于温度为25士 1°C，光照时间为16h. cf1，光照强度 为50 μ mol · m_2 · s—1的条件下培养。1. 4三种外植体培养8周以后，分别统计接种后生成的愈伤数量，并对数据进行统 计分析。1. 4. 1不同外植体在诱导培养基上的生长情况外植体A愈伤组织诱导的过程和外植体B和C有着明显的不同。外植体A接种后， 首先花序轴基部和幼蕾长大，在生长4周以后，幼蕾花柄膨大，花序轴和幼蕾上分别有微黄 色或白色的愈伤组织出现。外植体B和C的幼蕾在接种后生缓慢长，部分花蕾开放，在生长 四周后有微黄色的愈伤出现(见图1、3、4)。1. 4. 2不同外植体对洋葱愈伤组织诱导的影响实验结果表明，不同的外植体因其生理状态的不同，在提供相同的激素浓度配比 的情况下，其愈伤组织诱导的情况存在很大的差异。外植体A的每一个外植体都有愈伤组 织的出现，外植体的愈伤诱导率为100%，每个外植体上的愈伤组织的数量不同(图1)。外 植体B和C的愈伤组织的诱导见表2和表3。由表2，3知，外植体B (总苞被未开裂的花序中 的幼蕾)形成愈伤组织的平均诱导率为85. 49%，外植体C(总苞被开裂的花序中的幼蕾) 的平均诱导率为55. 78%。在相同的培养条件下，外植体B的处理的愈伤诱导率均高于外植 体C的处理。说明外植体A即幼嫩花序和外植体B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种洋葱愈伤组织诱导方法，其特征在于包括选取洋葱外植体，采用添加２，４－Ｄ、６－ＢＡ的Ｂ５培养基进行愈伤组织的诱导培养；所述的Ｂ５培养基中蔗糖浓度为３０ｇ／Ｌ，琼脂浓度为８ｇ／Ｌ，培养基ｐＨ值为５．８，添加的２，４－Ｄ浓度为０．５～２．０ｍｇ／Ｌ，６－ＢＡ浓度为１．０～４．０ｍｇ／Ｌ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王建军，刘照坤，侯喜林，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]