一种用于鸭禽流感口服黏膜免疫的复合佐剂制造技术

本发明专利技术涉及口服灭活疫苗的一种黏膜免疫的复合佐剂，属于生物技术领域，专用于口服灭活疫苗的应用。其配方为：２０～５０μｇ　ＣｐＧ　ＤＮＡ、２～５ｍｇ黄芪多糖和７０～１００ｍｇ葡萄糖。本发明专利技术（复合黏膜免疫佐剂）能够有效提高黏膜局部免疫和全身体液免疫力。同时复合佐剂与禽流感灭活抗原配合，通过饮水免疫就可以激发动物机体产生有效的全身免疫应答水平，避免肌肉注射引起的鸭群应激反应，也为提高鸭肉品质提供了保证。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于鸭禽流感口服黏膜免疫的复合佐剂，属于生物
专 用于提高灭活疫苗的黏膜免疫效果。
技术介绍
1消化道黏膜免疫的特点黏膜免疫系统是指机体与外界相通的腔道(包括呼吸道、消化道及泌尿生殖道) 黏膜表面的免疫。该系统在体内的覆盖面积很大(超过400m2)，形成动物体防御外界病原 物的第一道屏障，因此黏膜免疫系统在机体免疫系统中占有非常重要的地位。消化道淋巴 组织亦称肠相关淋巴组织(GALT)。分泌型IgA是黏膜免疫的主要效应因子，它不仅具有中 和病毒、抑制微生物吸附的作用，还具有免疫排斥及促天然抗菌因子的功能。黏膜免疫系统的传入诱导部位为派伊尔氏斑(Peyer’ s Patches，PP)和淋巴滤 泡，派伊尔氏斑位于回肠黏膜固有层并深入到黏膜下层，鸡的派伊尔氏斑为一粉红色椭圆 形斑，位于回盲交界处上方。派伊尔氏斑分为三个区①特化圆顶上皮区，②滤泡区或B细 胞区，③滤泡旁区或T细胞区。圆顶上皮区有特殊化的抗原识别细胞或称M细胞，它吞饮肠 腔内多种抗原。抗原被转运到派伊尔氏斑，在滤泡区受到加工，引起抗原特异性B和T淋巴 细胞兴奋。随后它们离开派伊尔氏斑，转移到黏膜固有层和上皮内的淋巴细胞。派伊尔氏 斑内的T细胞可激活B细胞，产生IgA。黏膜免疫系统的传出效应部位为黏膜固有层和上皮内的淋巴细胞。正常情况时， 肠黏膜固有层持续地含有大量浆细胞，其中70% 90%分泌IgA。固有层内浆细胞的前体 来自派伊尔氏斑，通过肠系膜淋巴和胸导管而到黏膜固有层。巨噬细胞占固有层内淋巴细 胞的10%。研究表明，上皮内淋巴细胞具有细胞毒活性和自然杀伤性淋巴细胞的活性，能分 泌多种细胞因子，参与肠道抗感染免疫和经口免疫耐受的形成，并在调节肠黏膜上皮细胞 功能方面起重要作用。微皱褶细胞(Microfold cell)简称M细胞，是一种特化的扁平上皮 细胞，与肠上皮细胞紧密排列在一起。微皱褶细胞浆具有丰富的吞饮小泡和线粒体。鸡的 派伊尔氏斑处也存在微皱褶细胞，并具有很强的饮液活性。微皱褶细胞主要摄取和运输颗 粒性抗原，如某些病毒、细菌等抗原性物质。黏膜免疫的效应位点也是诱导位点，消化道派伊尔氏斑中B细胞受到抗原刺激后 形成致敏的淋巴细胞通过全身循环除再分布到消化道以外还可散布到其它黏膜效应位点 (如乳腺、支气管黏膜、生殖道黏膜等)，B细胞在这些部位进行克隆扩增，一旦再接触到相 同抗原，在Th细胞和其分泌的细胞因子的辅助下，分化为分泌IgA的浆细胞。2黏膜免疫佐剂的研究进展目前，黏膜免疫佐剂已成为黏膜免疫的研究热点之一，它能引起局部和全身的免 疫反应。研究主要类型有细菌佐剂、核酸佐剂、细胞因子佐剂、无机成分佐剂和投递系统。研究发现卡介苗中含有特殊的核酸序列——CpG基序(寡脱氧核苷酸)，能特 异性的增加抗原的免疫原性。目前把含有未甲基化CpG基序的DNA、细菌的质粒DNA以及人工合成的寡核甘酸统称为CpG DNA,即核酸佐剂或具有免疫刺激作用的DNA序列 (immunostimulatory sequences, ISS)，当将它们与蛋白质抗原的疫苗共同使用时，可诱导 以细胞免疫为主的免疫反应。试验证实，CpG DNA作为黏膜佐剂能促进机体对乙型肝炎表面 抗原(HBsAg)的系统和黏膜免疫应答。CpG DNA可改进其它佐剂诱导Th2类型应答的缺点， 如把CpG DNA与霍乱毒素或氢氧化铝等佐剂联用，先诱导出混合型的Thl和Th2类应答，然 后转向Thl类型的应答。黄芪多糖(Astraglus Polysacchride, APS)是从植物黄芪中提取出的一种免疫 活性物质，能够增强机体免疫功能、增强细胞代谢，还可以作为免疫佐剂，具有免疫增强的 功能。此外，黄芪多糖还具有符合安全、稳定、低成本、可降解等黏膜免疫佐剂的优点。黄芪 多糖与金黄色葡萄球菌灭活苗混合免疫家兔和奶牛，血清特异性抗体滴度增加快且明显提 高，且抗体维持在一个较高水平。小鼠口服黄芪液能促进免疫反应早期阶段的T细胞和B 细胞的前体细胞增生。目前黄芪多糖口服液也已用于提高人类的免疫力。因此黄芪多糖是 一种有效的黏膜免疫佐剂。高浓度葡萄糖可使紧密连接相关蛋白Z0-I表达减少，细胞间连接松懈，增加黏膜 上皮细胞的通透性。本试验应用高浓度葡萄糖主要是增加禽流感灭活抗原的吸收。从本试 验中可以看出应用CpG DNA、黄芪多糖和高浓度葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫鸭，小 肠局部禽流感特异性抗体水平和IL-2和IL-6水平显著或极显著高于单独应用禽流感灭活 抗原和单独应用葡萄糖的水平，表明高浓度葡萄糖可能只促进禽流感抗原或CpG DNA的吸 收而没有免疫增强剂的作用，如果要提高灭活病毒抗原的黏膜免疫效果不仅需要高浓度葡 萄糖促进吸收，还需要免疫佐剂的配合。3黏膜免疫佐剂在消化道黏膜免疫中的意义动物传染病的传播大多都以消化道和呼吸道为主要途径。口服弱毒疫苗可以直接 刺激小肠黏膜内的淋巴细胞产生大量的IgA和多种细胞因子，在肠黏膜表面形成一层保护 膜，防御病原微生物的入侵。研究与实践证明消化道黏膜免疫不仅在黏膜局部和其它黏膜 组织产生免疫应答，还可引起全身性的体液免疫应答，因此黏膜免疫受到国内外免疫学家 的关注。消化道免疫(口服免疫)方法简便，省时省力，操作时不会引起动物的应激反应， 特别适用于大规模养殖的小型动物的免疫接种。但是单独应用灭活抗原和灭活疫苗不能引 起有效的免疫应答。免疫佐剂是掺入疫苗制剂后能促进、延长或增强对疫苗抗原特异性免 疫应答的物质。近来发现应用免疫增强剂配合灭活疫苗通过黏膜免疫动物可以取得较好的 效果。本试验巧妙地运用免疫增强剂CpG DNA和中药免疫增强剂黄芪多糖，再配合黏膜促 进吸收剂——高浓度葡萄糖作为鸭源禽流感抗原的复合佐剂，通过饮水免疫显著提高了鸭 黏膜局部和系统的免疫水平。4饮水免疫预防鸭禽流感的意义目前禽流感的发生给我国乃至全球养禽业均带来了严重的经济损失。禽流感不仅 在家禽中广泛传播，近几年水禽等其他动物感染禽流感病毒(AIV)发病和死亡的报道也越 来越多。水禽在感染禽流感后不仅能发病死亡，而且病毒可经宿主粪便排出体外，从而污染 环境，感染其他禽类和哺乳动物，因此控制水禽的禽流感对禽流感的防控具有重要的意义。预防禽流感有效的方法是注射禽流感疫苗。我国目前采取的主要方式是肌肉注 射油乳佐剂全病毒灭活苗，但此种免疫方式存在以下缺点浪费人力物力、注射时产生的应激反应影响动物生长、油乳佐剂的残留影响肉质等，另外水禽如鸭身体的特殊构造(鸭羽 毛湿滑、鸭绒茂密)也给肌肉注射带来更大的困难。消化道和呼吸道是诸多病原微生物感 染的主要途径，如果通过饮水免疫直接切断病原微生物的入侵和向外界释放的途径，将有 助于预防禽流感等传染性疾病。研究表明饮水免疫是预防消化道感染的有效途径。饮水免 疫与传统肌肉注射相比简便安全，省时省力，减少家禽的应激反应，避免对增重和产蛋的影 响，适于大规模养鸭。同时，由于饮水免疫时疫苗只作用于家禽的消化道黏膜组织(这些部 位在家禽肉质品加工中均被抛弃)，不会对禽类产品的质量产生较大影响，从而有利于我国 鸭肉产品的出口。能否将这一方法推广应用，有良好的免疫效果是基本前提。复合黏膜免 疫佐剂的应用可以提高免疫效果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鸭禽流感口服黏膜免疫的复合佐剂，其配方为：２０～５０μｇ　ＣｐＧ　ＤＮＡ、２～５ｍｇ黄芪多糖和７０～１００ｍｇ葡萄糖。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨倩，王红丽，康海泓，庾庆华，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]