细菌生物薄膜的酶破坏制造技术

治疗患者的方法，在这些患者中，受损组织或埋藏的假器官装置或导管中长有细菌生物薄膜，为了至少能部分地破坏该生物薄膜，可以至少施用一种抗细菌的酶，这种酶对形成生物薄膜的细菌是致命的或能损害它，施加的数量足以有效地破坏，至少是部分破坏与之相联系的生物薄膜。本发明专利技术也公开了预防治疗患者的方法，以及离体对表面进行消毒或杀菌，从而去掉生物薄膜或抑制生物薄膜生长的方法，此外，本发明专利技术还公开了容易生长生物薄膜的可植入性物体，在这些植入性物体上预防性地涂上了抗细菌的酶。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
相关申请的相互参照本申请根据35U.S.C.§119(e)要求美国临时申请No.60/368112的在先权益，该申请是2002年3月26日提交的，它的公开内容在此被引作参考。
技术介绍
1.专利
本专利技术涉及抗细菌酶对细菌生物薄膜(biofilm)的破坏。更具体而言，本专利技术涉及用溶葡球菌酶(lysostaphin)破坏葡萄球菌生物薄膜。2.技术背景A.生物薄膜粘附到植入的医疗器械或受损组织上的细菌用水合的多糖和蛋白基质将自己围住，形成粘液层，也就是已知的生物薄膜。生物薄膜会造成严重的公共卫生问题，因为它能使和生物薄膜相关的器官对抗微生物剂的抗性增加，并且使埋藏有医疗器械或组织受损的患者的器官的感染机会上升。生长在生物薄膜中的细菌对抗生素的抗性导致感染的持续和慢性化，这样的感染如和植入性医疗器械相关的感染。生物薄膜的抗性机制和现在熟知的对单个细菌细胞赋予内在的抗性的质粒、转座子、以及突变体的抗性机制不一样。在生物薄膜中，这种抗性看起来取决于多细胞策略(multicellular strategies)。生物薄膜是一种复杂的微生物群落，它粘附在表面，或者和界面或受损组织相关。尽管现在微生物学研究的焦点在纯培养的浮游细菌(自由游动)上，但现在广泛意识到，绝大部分在自然界，临床上和工业上发现的细菌以生物薄膜的形式和表面保持联系。此外，微生物群落通常由不同种属的微生物组成，这些微生物之间以及它们与环境之间相互作用。生物薄膜构造的确定，尤其是微菌落(细胞簇)在空间的相对排列对这些复杂群落的功能有深刻的含义。生物薄膜基质是个动态的环境，在这个环境中，微生物细胞成分达到了动态平衡，组织优化，以利用所有可获得的营养。因此，该基质表示出巨大的微观不均一性，在这种不均一性中，存在不同的微环境。一般认为生物薄膜通过两步形成，首先是细菌细胞粘附到表面，接着细菌生长，进而积累形成多层细胞簇。尽管细胞外聚多糖能提供基质框架，但在生物薄膜中能发现大范围的酶活性，这些酶中的一些能显著的影响结构的统一性和稳定性。更具体地说，在生物薄膜形成的第一个阶段，假设宿主原生质的纤维蛋白原和纤连蛋白覆盖植入的医疗器械和受损组织的表面，并被组成型表达的微生物表面成份所识别，从而能介导细菌最初粘附到生物材料或受损组织上。在第二步中，细菌细胞中叫胞内粘附(ica)位点的特异基因位点能激活细菌细胞间的相互粘连，形成生物薄膜的次级各层。Ica位点负责荚膜多糖操纵子的表达，通过一种1，6连接的葡糖胺聚糖，聚-N-琥珀酰葡糖胺(PNSG)激活细胞间脂多糖粘附素(PIA)。由于这层多糖，使得在电子显微镜下观察时，生物薄膜外表呈粘液状。金黄色葡萄球菌是一种高致命的人类病原菌。金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌都是在植入的医疗器械和受损组织形成生物薄膜的过程中伴随出现的主要院内病原菌。这些生物位于人皮肤和粘膜的正常carriage flora中，使得它成为侵入性外科手术或延长住院时间的并发症。因为健康和患病的人中都携带有细菌，而葡萄球菌能通过开放的伤口和植入的生物材料侵入患者，因此被认为是机会致病菌。伴随金黄色葡萄球菌出现的生物薄膜感染是致病和死亡的一个重要原因，尤其是在诸如医院，疗养院和养老院等地方。处在危险中的患者包括婴儿，老人，免疫受损的人，免疫抑制的人以及那些患慢性疾病，而必须经常待在医院的人。那些在血管或其他地方有植入性假器官(prosthetic)装置的患者受到葡萄球菌感染的危险甚至更大，因为受损的免疫系统和异物的导入损害了组织，以及/或者成为形成生物薄膜的表面。这种传染，如果不是致命的，就是慢性的。导管(catheter)相关感染仍然是进行导管插入术患者致病率和死亡率的重要原因。在美国，报告的致病率和死亡率是4％，等于每年200,000人。此外，导管相关感染的致死率是14-24％，而且由于延长住院治疗，医疗费用上升。因此，预防或甚至减少导管相关感染病例会带来显著的保健好处。导管感染最普通的是由葡萄球菌引起的，不管是凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)或金黄色葡萄球菌。由CoNS引起的感染可能是温和的，有些可以通过去掉导管或适当地用抗生素处理导管进行治疗。金黄色葡萄球菌引发的感染通常更严重，而且除了进行抗生素治疗外，还必须去掉导管或其他假器官装置。金黄色葡萄球菌是一个巨大的毒素制造者和高毒性的人类病原菌。它是不同人类疾病的起因，从局部的皮肤感染到威胁生命的菌血症和一些至关重要器官的感染。如果不迅速控制，金黄色葡萄球菌引发的感染会从最初的感染位点向其他器官快速扩散。尽管感染的中心并不明显，但对感染特别敏感的器官包括心瓣膜，肾，肺，骨骼，脑膜以及灼伤患者的皮肤。尽管开发了一些抗微生物剂，这些药剂对抗生素敏感葡萄球菌所引发的感染有效，但为了消除持续和慢性的葡萄球菌感染，仍然需要那些能持续和彻底杀死具抗生素抗性的金黄色葡萄球菌，尤其是那些和生物薄膜相关的葡萄球菌的药剂，其中生物薄膜是在植入的假器官装置和受损组织上。不幸的是，生物薄膜上的金黄色葡萄球菌(甚至那些处于浮游状态，对抗生素敏感的葡萄球菌)对抗生素敏感性低，因此感染更难清除。生物薄膜对抗生素具抗性的原因包括一些抗微生物剂不能穿透各层生物薄膜，某些生物薄膜细胞生长速率缓慢，而抗微生物剂对活跃生长的细菌有作用，从而使得它们对这些药剂的敏感性比较低，以及包含在生物薄膜中的细菌细胞基因表达类型与它们浮游状态(自由游泳)时的基因表达方式不一样。生物薄膜相关细菌细胞的这些差异使得能有效杀死浮游细菌的抗微生物剂不能有效地杀死生物薄膜相关细菌。通常治疗伴随有生物薄膜的导管或假器官装置的唯一方法是去掉污染的装置，而这要求额外的手术，这会进一步增加患者的危险。在导管或假器官装置上涂上抗微生物剂是控制和预防异物相关感染的有前途的方法。目前，临床上已经测试了六种灭菌的导管，分别是涂了头孢唑啉，替考拉宁，万古霉素，银，氯己啶-磺胺嘧啶银和米诺环素-利福平的导管。然而，只有涂了米诺环素-利福平的导管能减少导管相关血液感染(CRBI’s)的发生，但它的长期效力没研究过。很明显有必要寻找一种新的抗微生物剂，它能降低CBI’s，从而提高导管的持久性，而且这种药剂还能适当清除导管，假器官装置和受损组织中生物薄膜相关葡萄球菌感染，而不用进行手术。B.溶葡球菌酶最初认为对生物薄膜无效的抗微生物剂是溶葡球菌酶。溶葡球菌酶是模仿葡萄球菌(以前叫Staphylococcus staphylolyticus)中确定的第一个有效的抗细菌酶。溶葡球菌酶是一种细菌甘氨酰丙氨酸内肽酶，能剪切葡萄球菌细胞壁中的特异交联聚甘氨酸键，因此对活跃生长和静息的葡萄球菌都是高致命的。溶葡球菌酶以单一多肽链表达，分子量大约是27kDa。溶葡球菌酶对裂解金黄色葡萄球菌特别有效，因为金黄色葡萄球菌的细胞壁键中含有高比例的甘氨酸。溶葡球菌酶也表示出裂解表皮葡萄球菌的能力，表皮葡萄球菌是医院中最常见的凝固酶阴性细菌。然而，由于生物薄膜构造以及溶葡球菌酶裂解葡萄球菌机制的复杂性，并不希望溶葡球菌酶能有效地抵抗已经生成的生物薄膜中的葡萄球菌。Clim等人的美国专利No.6028051公开了一种用溶葡球菌酶治疗由葡萄球菌引起的疾病的方法。在治疗中使用了相对高剂量的溶葡球菌酶，每千克体本文档来自技高网...

【技术保护点】
治疗患者的方法，在所述患者受损组织或植入性假器官装置或导管中，生长有细菌生物薄膜，所述治疗至少部分破坏所述生物薄膜，所述方法包括给所述患者施用至少一种抗细菌的酶，这种酶对形成生物薄膜的细菌是致命的，或者能损害它，施加的数量足以有效地至少部分破坏和它接触的生物薄膜。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J科凯昆，J蒙德，S瓦尔斯，A沙，T钱图里亚，J亚当斯吴，
申请(专利权)人：J科凯昆，J蒙德，S瓦尔斯，A沙，T钱图里亚，J亚当斯吴，
类型：发明
国别省市：US[美国]