庆大霉素ＥＬＩＳＡ检测试剂盒制造技术

本实用新型专利技术涉及一种检测动物源性食品中庆大霉素含量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括：９６孔酶标板、酶标二抗、庆大霉素抗体工作液、庆大霉素６个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、高浓度标准品、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ＥＬＩＳＡ方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中含有的庆大霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗庆大霉素抗体，加入酶标二抗后，用ＴＭＢ底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中庆大霉素的含量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在肌肉、肝脏中庆大霉素的残留检测中发挥重要作用。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及检测庆大霉素残留量的试剂盒，特别是检测肌 肉、肝脏中庆大霉素残留量的酶联免疫试剂盒。 ( 二 )
技术介绍
庆大霉素(Gentamicin)是氨基糖甙类抗生素，被广泛应用于动 物疾病的治疗，由于其具有神经毒性和肾脏毒性，在动物食品中的残留会影响人类健康，欧 美国家及我国均要求其限量使用。 检测庆大霉素残留量的化学方法目前有高效液相色谱法，由于复杂的仪器设备和 繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。(三)
技术实现思路
本技术所要解决的问题是提供一种小巧轻便的庆大霉 素残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技 术含量不高，可进行一次连续多个样品中庆大霉素残留量的测定，减少了检测样本所需要 的时间。 本技术的技术方案是一种检测动物源性食品中庆大霉素残留量的酶联免疫 试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶 位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于采用96孔聚苯乙烯试剂板作为 固相载体，酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆 装酶标反应微孔条有8个反应孔，在试剂盒酶标板微孔条上预包被庆大霉素偶联抗原制成 检测板，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，以塑料硬膜为盖板膜，将放入真空铝箔袋中，将 6瓶lml梯度浓度的标准品溶液、lml高浓度标准品溶液、12ml酶标二抗、7ml庆大霉素抗体 工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、7ml终止液、40ml浓縮洗涤液、50ml浓縮复溶液试 剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与酶标板、盖板 膜、自封袋、说明书、质控报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的 试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将 板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果 的准确性。检测时，样本中的庆大霉素将和酶标板微孔条上预包被的庆大霉素偶联抗原竞 争抗庆大霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含庆大霉 素的残留量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中庆大霉 素残留量，其操作简便易行。 经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度肌肉样本的最低检测限为4ii g/kg、肝脏样本的最低检测限为4ii g/kg ;肌肉样本的回收率为90% ±10% ;肝脏样本的回收率为90% ±10% ;相对于其他庆大霉素检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、恒温箱、涡旋仪、离心机和微量加样器，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。 本技术的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于庆大霉素残留量的检附图说明 图1为本技术酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm); 图2为本技术酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm); 图3为本技术酶联板的俯视图； 图4为本技术盖板膜平面图； 图5为本技术试剂瓶纵剖面平面图； 图6为本技术固定泡沫模具的俯视图； 图7为本技术盒体与固定泡沫模具的侧视图。 参见附图酶标反应微孔条(2)预包被庆大霉素偶联抗原(3)固定于酶标板的外 框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温 箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2);透明帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓縮 洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装50ml浓縮复溶液；白色帽(6)的白色塑 料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色帽(6)的黑色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml 显色液B液，黄色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，红色帽的白色塑料试 剂瓶(8)用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装7ml庆大霉素抗 体工作液，白色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用于封装lml/瓶的标准品溶液及lml高浓度标 准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为40ml浓縮洗涤液瓶位(18)， 50ml浓縮复溶液(11) ， 7ml显色液A液瓶位(14) ， 7ml显色液B液瓶位(13) ， 7ml终止液瓶 位(12) ，7ml庆大霉素抗体工作液瓶位(16) ， 12ml酶标二抗瓶位(15) ，6种lml/瓶各种浓 度的标准品溶液及1瓶lml高浓度标准品溶液瓶位(17)，盒体为(19)是硬纸盒。具体实施方式本技术的实施例 —、样本的前处理 1.配液 配液1 :0. 1M PBS溶液(PH = 10-11) 称取13. 4g十二水合磷酸氢二钠、20g氯化钠、0. 32g氢氧化钠、0. 5g二水合磷酸二 氢钾、0. 5g氯化钾加去离子水溶解定溶至500ml。 配液2:洗涤工作液 用去离子水将20X浓縮洗涤液按1 : 19体积比进行稀释(1份20X浓縮洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4t:环境可保存一个月。 配液3:复溶工作液 用去离子水将2X浓縮复溶液按1 : 1体积比进行稀释(1份2X浓縮复溶液+1份去离子水)，用于提取样本的复溶，复溶工作液在4t:环境可保存一个月。 2.以庆大霉素标准品添加的肌肉、肝脏样本处理步骤称取2. 0±0. 05g去均质样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入6ml 0. 1M PBS(PH =10 11)缓冲液6ml，混匀10min ;置于6(TC水浴环境中60min，取出冷却至室温并摇匀； 3000g以上，室温离心10min ;移取上清液，加入复溶工作液，以1 : 9的体积比进行稀释 (50 ii 1上清液+450 ii 1复溶工作液)；取50 iU用于分析。 二、使用试剂盒的操作步骤 1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温(20-25°C )平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 2、取出板架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8t:。 3、洗涤液在使用前也需要回温。 4、编号将样本溶液和标准品工作液对应微孔按序编号，每个样品溶液和标准品 工作液做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 5、加标准品工作液/样本溶液加标准品工作液/样本溶液50 ii 1到各自的微孔 中，然后加抗体工作液50ia/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，37t:环境中反应30min。 6、取出微孔板，甩出孔内液体，用洗涤液按250iil/孔洗板4-5次，每次浸泡10 秒，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头剌破)。 7、加入酶标二抗工作液100 iU/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板置于37t:环境 反应30min，取出重复步骤7。 8、显色每孔先加入底物液A液50iil，再加B液50ia，轻轻振荡混匀，37t:环境 中避光显色15min。 9、测定每孔加入终止液50 ii 1，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用 双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD (若无酶标仪，则不加终止液用 目测法可进行判定)。 三、结果判定 结果判定有两种方法，粗略判定可用第l种方法，定量判定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测动物源性食品中庆大霉素残留量的酶联免疫试剂盒，包括盒体和盒内的一块９６孔的酶标板、一张盖板膜、１４瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于：酶标板是采用９６孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被庆大霉素偶联抗原制成的检测板，１４瓶试剂分别６瓶标准品溶液、１瓶高浓度标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液Ａ液、显色液Ｂ液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共１５个。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，万宇平，冯才伟，冯才茂，赵正苗，汪善良，冯静，刘福林，刘平，李勇，何勇，王立志，
申请(专利权)人：北京望尔康泰生物技术有限公司，北京望尔生物技术有限公司，
类型：实用新型
国别省市：11[中国|北京]