一种改性多孔板的制备方法技术

本发明专利技术属于医疗器械改性领域和纳米材料领域，具体涉及一种改性多孔板的制备方法，包括以下步骤：（１）在０～２５℃范围内，配制含有碳酸氢钾、葡萄糖，氯金酸的水溶液，然后用碱溶液将溶液ｐＨ调节至９．０～１０．０，然后冷却；（２）以每孔５０～２５０μＬ的量，将步骤（１）所得溶液加入到多孔板的孔中，然后于２５～５０℃下加热１～６小时，弃去孔中溶液，再用去离子水冲洗２～３次后，即制得稳定的纳米金颗粒聚集体修饰的多孔板。本发明专利技术采用化学还原的方法生成金纳米粒子并通过物理沉降作用吸附在多孔板表面形成稳定、形貌均一的纳米金颗粒聚集层，由于这种纳米金聚集层巨大的比表面积和独特的三维结构，这种经过修饰的表面可以提高蛋白结合量，因此，修饰后的多孔板可以实现超高灵敏度的酶联免疫吸附测试。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医疗器械改性领域和纳米材料领域，具体涉及一种在酶标板表面修饰 纳米金粒子层的方法，采用修饰了纳米金粒子层的多孔板(包括酶标板)可显著提高传统 酶联免疫吸附试验的检测限。
技术介绍
在基于固相载体的多种免疫诊断领域中，酶联免疫吸附测试(ELISA)作为一种最 重要的疾病诊断技术具有灵敏度高，操作简单，低成本，适应性强等优点，因此被广泛应用 于科研及医疗领域。然而，对于很多恶性疾病的早期阶段，血液中相关特征蛋白含量极其微量，往往低 于市售的商品化ELISA试剂盒的检测限。其中一个重要原因在于，市售ELISA试剂盒中酶 标板由于自身理化性质的局限，而使得其对样品中疾病特征抗原的结合量较低，结合上的 抗原表位的暴露不充分。因此，对酶标板表面进行改性以提高单位面积特征抗原的结合量 并促进抗原表位的充分暴露已成为提高检测限的必然途径。现有技术中，常用的方法有以下几种(1)通常采用紫外照射法，等离子体处理法等方法来处理酶标板表面以提高其对 抗原的结合能力；但这种方法都需要特殊设备，成本高，操作较为复杂，此外，这些方法改性 后的表面只能一定程度上增加抗原的结合量，并不能促进抗原表位的充分暴露。(2)而珠式、管式及磁性球ELSIA法虽然可以解决这一问题，但是整个实验过程复 杂，成本高，需要特殊的仪器设备。因此，需要研发一种成本低且工艺简单的修饰改性多孔板(包括酶标板)的方法， 使得改性后的多孔板对样品中疾病特征抗原的结合量提高，能充分暴露结合上的抗原表 位。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，得改性后的多孔板对样品中疾 病特征抗原的结合量提高，能充分暴露结合上的抗原表位。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为，包括以下 步骤(1)在0 25°C范围内，配制含有碳酸氢钾、葡萄糖，氯金酸的水溶液，然后用碱溶 液将溶液PH调节至8. 0 10. 0，然后在0 4°C冷却；最终所得溶液中，碳酸氢钾、葡萄糖、 氯酸金的终浓度依次为20-60mg/mL，2-8mg/mL，2-8mg/mL ；(2)以每孔50 250 μ L的量，将步骤(1)所得溶液加入到多孔板的孔中，然后于 25 50°C下加热1 6小时，弃去孔中溶液，再用去离子水冲洗至少2次后，即制得稳定的 纳米金颗粒聚集体修饰的多孔板。上述技术方案中，碳酸氢钾、葡萄糖，氯金酸粉末均为分析纯，所用溶剂水为去离子水。上述技术方案中，所述碱溶液为本领域技术人员公知的中强碱，不与反应体系中 物质发生反应且能将最终溶液的PH值调节到8. 0 10. 0即可，如氢氧化钠、氢氧化钾或碳 酸钠。上述技术方案中，所述多孔板包括商用384孔板、96孔组织培养板、96孔酶标板、 可拆卸的酶标板、48孔组织培养板或M孔组织培养板等。本专利技术的原理是采用化学还原的方法生成金纳米粒子并通过物理沉降作用吸附 在多孔板(包括酶标板)表面形成稳定、形貌均一的纳米金颗粒聚集层，由于这种纳米金聚 集层巨大的比表面积和独特的三维结构，这种经过修饰的表面可以提高蛋白结合量，因此， 修饰后的多孔板可以实现超高灵敏度的酶联免疫吸附测试。由于上述技术方案的应用，与现有技术相比，本专利技术具有以下突出特点1.本专利技术所述技术方案中，配制好反应溶液后，将溶液于冰浴中冷却平衡至低温， 然后再将这种冷却的反应液加入到微孔板中，然后将微孔板置于25 50°C下反应；由于进 行了低温冷却操作，降低了溶液中初始氧化还原反应速率，从而有利于形成粒径较小的金 纳米粒子，这种最初形成的极细粒径的金纳米粒子与高温时反应生成的较大粒径的金纳米 粒子聚集体相比更容易在微孔板表面形成稳定，致密的吸附层；反应过程中，随着微孔板内 反应液温度达到25 50°C时，溶液反应速率增大，后续快速形成的金纳米粒子以先前沉积 的小金纳米粒子为晶种，在其表面发生聚集，并最终形成了我们所得到的稳定的金膜。2.本专利技术所述技术方案中，选择pH值8-10的条件进行金纳米粒子的均勻沉积，较 低的PH值不能及时消除反应产成的酸性物质，阻碍了反应的进一步进行；而较高的pH值导 致金纳米粒子的快速生成和团聚。因此，只有PH值8-10的条件才能在微孔板表面产生稳 定均勻的金膜。3.本专利技术所述修饰多孔板的方法无污染，低成本，工艺简单，工艺过程容易控制， 整个制备反应过程温度不超过50°C ；利用本方法制备的纳米金聚集层修饰的多孔板，可以 根据实际检测需要，来进行多种形式的免疫检测。如在本专利技术制备的多孔板表面上吸附上 含待测抗原的样本就可以进行间接法或竞争法检测；预先吸附上检测特征抗原的抗体就可 以进行双抗体夹心法检测。4.本专利技术对材料的适用性好，材料可以是各种常见的多孔板，如商用384孔板，96 孔组织培养板，96孔酶标板、可拆卸的酶标板，48孔组织培养板或M孔组织培养板。5.本方法为纯粹的化学方法，不需要紫外光照，等离子体等昂贵设备处理，经济 可行；采用化学还原的方法生成金纳米粒子并通过物理沉降作用吸附在多孔板(包括酶标 板)表面形成稳定、形貌均一的纳米金颗粒聚集层，由于这种纳米金聚集层巨大的比表面 积和独特的三维结构，这种经过修饰的表面可以提高蛋白结合量，因此，修饰后的多孔板可 以实现超高灵敏度的酶联免疫吸附测试。附图说明图1中为实施例一中利用间接法ELISA分别于普通96孔高吸附酶标板以及经过 纳米金聚集层修饰过的酶标板(由100 μ L工作液形成)检测单一抗凝血酶溶液中抗凝血 酶含量的结果对比；图2中为实施例二中利用间接法ELISA分别于普通96孔高吸附酶标板以及经过 纳米金聚集层修饰过的酶标板(由250 μ L工作液形成)检测人血浆稀释液中抗凝血酶含 量的结果对比。具体实施例方式以下实施例提供了金纳米颗粒修饰多孔板的制备方法，以及修饰后的多孔板在疾 病诊断中的应用，是通过化学方法在普通多空板表面形成三维的金纳米颗粒聚集层，再以 这种经过修饰的多孔板进行超低检测限的间接法酶联免疫吸附测试。下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步说明，但不限制本专利技术。实施例一(1)将0. 3g碳酸氢钾(分子量100)，0. 03g葡萄糖(分子量198)，30mg氯金酸粉 末溶解于6mL去离子水中，并用氢氧化钠溶液将pH值调节到9. 0。(2)吸取该工作溶液100 μ L加入酶标板中，再将酶标板置于25°C烘箱中反应6小 时。弃去孔中反应液，再用去离子水冲洗3次即制得纳米金颗粒聚集体修饰的酶标板。(3)将人抗凝血酶用碳酸盐缓冲液(pH = 9. 6)进行逐级稀释，得到浓度依次为 96ng/mL, 19. 2g/mL, 3. 84ng/mL,0. 768ng/mL的蛋白溶液。以每孔100 μ L用量将上述梯度溶 液包被于普通酶标板和经过修饰的酶标板中，于37°C烘箱温育2小时。弃去板中包被溶液， 用洗板液洗涤3次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体，以每孔300 μ L加入含1. 5%牛血 清白蛋白的封闭液，于37°C封闭1小时。弃去封闭液，于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。 每孔加入100 μ L羊抗人抗凝血酶抗体稀释液(1 1000稀释)，于37°C温育1小时。弃去 板中抗体溶液，用洗板液洗涤5次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入100 μ L 碱性磷酸酶标记的兔抗羊二抗稀释液(1 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改性多孔板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）在０～２５℃范围内，配制含有碳酸氢钾、葡萄糖，氯金酸的水溶液，然后用碱溶液将溶液ｐＨ调节至８．０～１０．０，然后在０～４℃冷却；最终所得溶液中，碳酸氢钾、葡萄糖、氯金酸的终浓度依次为：２０－６０ｍｇ／ｍＬ，２－８ｍｇ／ｍＬ，２－８ｍｇ／ｍＬ；（２）以每孔５０～２５０μＬ的量，将步骤（１）所得溶液加入到多孔板的孔中，然后于２５～５０℃下加热１～６小时，弃去孔中溶液，再用去离子水冲洗２～３次后，即制得稳定的纳米金颗粒聚集体修饰的多孔板。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红，周峰，袁琳，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32