中华鲟人工授精方法及所用稀释液技术

本发明专利技术公开了一种中华鲟人工授精方法及所用稀释液。所述的方法，是采用稀释液Ａ液和Ｂ液作授精介质，用二次湿法操作，第一次用Ａ液淘洗卵子去除卵巢液，第二次用Ｂ液激活卵子和精子并使精子分散均匀授精；所述的稀释液，为Ａ液和Ｂ液，Ａ液由ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ↓［２］.２Ｈ↓［２］Ｏ、ＭｇＣｌ.６Ｈ↓［２］Ｏ、ＮａＨＣＯ↓［３］、Ｎａ↓［２］ＣＯ↓［３］、ＮａＯＨ、柠檬酸、青霉素、链霉素、蒸镏水配制而成，Ｂ液由Ａ液以２５倍体积的蒸镏水稀释而成。本发明专利技术解决的问题是，避免不利自然因素对人工授精的卵、精的损坏，提高卵、精激活率、受精率、降低致畸率、节省精液用量，从而使中华鲟人工授精对野生雄鲟捕捞数量的依赖降低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及鱼类人工授精技术。
技术介绍
中华鲟属江海洄游的大型鱼类。由于长江水利工程建设、水质污染的加剧以及捕捞强度增大等因素，中华鲟种群锐减，现已成为国家一级保护动物。提高中华鲟人工繁殖及人工增殖放流技术以帮助该种群的恢复，成为水产科学研究的重要课题。进行中华鲟人工繁殖，需要中华鲟亲鱼，由于政府特许的捕捞减少，能获得的中华鲟亲鱼极少，而其中的雄性亲鱼更加稀少。因此，提高授精率，是人工繁殖摆脱资源条件制约的关键。目前，鱼类人工授精的方法共有三种干法、半干法、湿法。干法是发现雌鱼即将产卵时，一人用手按住雌鱼生殖孔，将鱼提出水面，擦去鱼体水份，另一人将卵挤入干盆中，用同样的方法立即向盆内挤入雄鱼精液，用手或羽毛轻轻搅拌，约1～2分钟，使精卵充分混合，然后，加入清水激活，再轻轻搅拌1～2分钟，静置约1分钟，倒去污液，人工授精即告完成。半干法的区别是，将挤出或用吸管吸出的精液用0.3～0.5％生理盐水稀释，然后倒在卵上，再搅拌。湿法的区别是将精、卵同时挤在盛有清水的盆中，不断搅匀授精。中华鲟的人工授精，始于70年代。多年来所采用的方法是分别将雌鱼的卵子和雄鱼的精子挤出，按每3～4万粒卵加约15毫升的精液，轻轻搅拌，充分混合均匀，然后加水300～500毫升，再轻轻搅拌1～2分种，静置约1分钟，倒去污液。所加入的水为长江水或者井水、自来水等淡水，是激活精、卵的授精介质。用这种方法所获得的受精率一般为51.9％。这种人工授精方法的受精率之所以不高，其原因主要为 1.直接使用长江水或者其它淡水作中华鲟人工授精的授精介质，由于工业活动的加剧，有各种生产废液废渣排到水中和地下，使不同水源的成分各异且复杂，不同水质影响精卵激活率的因素差异较大，尤其是PH值不尽相宜，导致精子某些酶的活性被抑制，致使精子丧失授精能力。2.作为授精介质的淡水一旦受到污染(如重金属、有机磷等)，对卵子、精子有毒害作用，使其丧失活力，直接影响受精率，而且增加胚胎的畸变。3.人工授精，挤卵带出许多卵巢液，而中华鲟的卵巢液十分粘稠，与卵子裹在一起，采用干法授精，当精液加入后，许多精子被卵巢液粘住，加淡水激活后，也不能快速运动穿透卵子受精孔，使一些卵子得不到授精。4.操作中，用作授精介质的淡水成分、渗透压、PH值不确定，其用量、各环节的时间控制不准确，存在随机随意性。现有的中华鲟人工授精方法，除了受精率低的问题外，还存在精液用量大的问题。这是因为，中华鲟卵粒大且量大，附带的卵巢液粘稠又粘住许多精液，为了让精、卵充分混合，所以，必须使用大量的精液。这使中华鲟人工受精的资源成本加大，使本来就宝贵的雄亲鱼显得更加紧缺。水生动物受精多以水为介质(淡水、海水)，淡水的低渗透压能激活淡水鱼类精子快速运动，海水中的K+离子或不同盐度的海水能激活海水鱼类精子快速运动。而研究鱼类尤其是江海洄游鱼人工授精稀释液鲜有报导。大黄鱼稀释液由NaCl、KCl、NaHCO3、葡萄糖等组成，盐度为10‰时，大黄鱼精子不被激活，在盐度为20～30‰时，90％精子被激活(林丹军等，2002年)；大银鱼在下列配制的稀释液中精子寿命最长NaCl 7.47g、KCl 0.29g、CaCl 20.22g以1升蒸馏水稀释(李勃等，1997)。
技术实现思路
本专利技术的目的，是为中华鲟人工授精提供一种方法，以提高受精率、降低致畸率、节省精液用量，从而减小对野生雄性亲鱼捕捞数量的依赖。本专利技术的另一目的，是为实施该方法提供一种稀释液，以保证该方法实现要达到的目的。本专利技术的技术方案是分别取得和收集卵子、精子，按卵子数∶精液量＝1万粒∶1.33ml分量卵、精；按卵子数∶A液∶B液＝1万粒∶166.7毫升∶66.7毫升分量A液、B液；将A液倒入卵子中，用手单旋向轻搅20秒，迅速将手停在中央10秒，在30秒内将上层粘液倒掉，加入精液，轻搅20秒，加入B液，轻搅2分钟；所述的A液，是按在每1000毫升的蒸馏水中，以下列物质及其含量所配制的人工授精稀释液NaCl 6.78g、KCl 1.56g、CaCl2·2H2O 0.20g、MgCl·6H2O 0.22g、NaHCO30.30g、Na2CO30.14g、NaOH 0.18g、柠檬酸0.10g、青霉素80万单位、链霉素80万单位；所述的B液，是由A液以25倍体积蒸馏水稀释得到，操作在气温和所述稀释液的温度为15～26℃下进行。本专利技术，授精介质采用稀释液A液和B液，操作采用二次湿法。第一次是用A液淘洗卵子，湿法下，卵巢液分子间的结合力被稀释液破坏或减弱，从而降低其粘稠度，使卵巢液溶入稀释液随之排出；第二次是用B液激活卵子和精子，并将精子密度降低，让其均匀分散在卵子之中，实现授精。作为本专利技术授精介质的稀释液，是参考中华鲟血液成分而配制，NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、MgCl·6H2O、NaHCO3、Na2CO3在溶液中，各离子之间协同作用，使之成为平衡液；通过蒸馏水稀释，分成A液和B液，柠檬酸和NaOH使溶液在用于不同环节时具备所需的PH值，各组分的含量使溶液在用于不同环节时具备所需要的渗透压，A液中渗透压为289mosmol/kg、PH值为7.4，卵子用A液淘洗时，其环境条件与卵巢液的相仿，A液经25倍稀释成B液后，渗透压为265mosmol/kg、PH值为7.1，正适宜卵子打开受精孔和精子快速运动，卵子、精子在稀释液中就象在中华鲟体内一样；青霉素和链霉素使稀释液具备抗菌功能。与中华鲟人工授精的现有技术相比，本专利技术所具的有优点是1.授精介质采用配制的稀释液，成分、渗透压、PH值稳定，避免污染，消除了不利自然因素对受精率的影响。2.采用A液和B液二次湿法操作，适合中华鲟特有的生理现象，分步解决了轻松快捷除去粘稠量大的卵巢液和高比率激活精、卵的问题。3.稀释液近似中华鲟体液，是一种等渗溶液，卵子在A液中能得到保护，保持原本的体征，B液能为精子补充能量，延长其存活时间，B液中恰当的渗透压和PH值能抑制精子的代谢进程，减少精子本身的营养消耗，增强精子抗外界环境变化的能力，而且特别适宜卵子受精孔的打开和精子的快速运动。4.B液的使用还使精液量增加，使精子的密度降低，分布分散，提高其利用率。5.操作规范，效果稳定。上述特点的综合效果是使精、卵的激活率、受精率大为提高，畸变率降低，而精液的用量得到节省。这些均有利于减少对雄鲟的捕捞，利于中华鲟自然种群的保护。应用本专利技术和现有技术分5次对中华鲟人工授精进行了对比试验，试验中，本专利技术授精介质为稀释液A液和B液，操作采用二次湿法；现有技术授精介质为长江水，操作采用干法，同在气温23℃、水温20℃条件下进行。结果是现有技术5次的受精率分别是25.7％、45.1％、52.3％、62.4％、74％，平均受精率为51.9％，5次的致畸率分别是15.7％、23.1％、20.5％、21.2％、9.5％，平均致畸率为18.0％，精液用量3万粒卵时用精液量＞10ml。本专利技术5次的受精率分别是65.2％、67.4％、71.3％、75.3％、98.3％，平均受精率为75.5％，5次的致畸率分别是2.3％、2.1％、0.8％、0.5％、0.3％，平均致畸率为1.2％，精液用量3万粒卵时用精液量为4ml。对比试验表明本专利技术平均受精率高于现有本文档来自技高网...

【技术保护点】
中华鲟人工授精方法，其特征在于，分别取得和收集卵子、精子，按卵子数∶精液量＝１万粒∶１．３３ｍｌ分量卵、精；按卵子数∶Ａ液∶Ｂ液＝１万粒∶１６６．７毫升∶６６．７毫升分量Ａ液、Ｂ液；将Ａ液倒入卵子中，用手单旋向轻搅２０秒，迅速将手停在中央１０秒，在３０秒内将上层粘液倒掉，加入精液，轻搅２０秒，加入Ｂ液，轻搅２分钟；所述的Ａ液，是按每１０００毫升的蒸馏水中，以下列物质及其含量所配制的人工授精稀释液：ＮａＣｌ６．７８ｇ、ＫＣｌ１．５６ｇ、ＣａＣｌ↓［２］.２Ｈ↓［ ２］Ｏ０．２０ｇ、ＭｇＣｌ.６Ｈ↓［２］Ｏ０．２２ｇ、ＮａＨＣＯ↓［３］０．３０ｇ、Ｎａ↓［２］ＣＯ↓［３］０．１４ｇ、ＮａＯＨ０．１８ｇ、柠檬酸０．１０ｇ、青霉素８０万单位、链霉素８０万单位；所述的Ｂ液，是由Ａ液以２５倍体积蒸馏水 稀释得到，操作在气温和所述稀释液的温度为１５～２６℃下进行。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鉴毅，危起伟，杨德国，陈细华，朱永久，王凯，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：42[中国|湖北]