蛋鸡肝细胞的制备方法技术

蛋鸡肝细胞的制备方法，本发明专利技术属于医学生物技术领域。该方法包括了蛋鸡血管结扎、肝脏的体内灌流和肝细胞洗涤三个过程，该发明专利技术有效提高了分离肝细胞的数量和活率，方法适用于蛋鸡、或蛋鸭、或其他蛋用家禽，制备的肝细胞可广泛用于禽类肝细胞的研究、禽类脂类代谢研究等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学生物
，涉及蛋鸡肝细胞的制备技术。
技术介绍
肝脏是禽类重要的器官，具有合成、代谢、解毒等功能。由于肝脏是家禽脂类代谢 的主要场所，因此培养家禽肝细胞对研究脂类代谢具有重要意义。目前肝细胞的培养方法 主要集中在哺乳动物上，但由于禽类的解剖结构与哺乳动物差异大，因此需要建立适合禽 类的肝细胞制备方法。禽类的肝细胞制备目前多采用离体灌流法和体内灌流法。采用离体灌流法制备的 肝细胞活率低，剥离肝门静脉时会翻动肝脏，容易对肝脏造成损坏和污染，降低了肝细胞制 备的成功率。因此离体灌流法还无法代替体内灌流法。体内灌流法目前集中于肉禽和雏禽 肝细胞的制备。蛋禽因具有发达的输卵管静脉丛，输卵管静脉与肝门静脉相通，按原有的体 内灌流法会导致灌流液无法完全进入肝脏，肝细胞制备失败。因此本专利技术的目的在于建立 蛋鸡肝脏的体内灌流方法，进一步探求高质量的蛋鸡肝细胞分离技术，提供更为合理的蛋 鸡肝细胞的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的方案为一种，主要包括蛋鸡血管结扎、肝脏的体 内灌流和肝细胞洗涤三个过程，其特征在于所述蛋鸡血管结扎采用下述(1)_(5)过程(1)将消毒麻醉好的蛋鸡放入超净台，从腹部中间起始，拨开腹部和胸部皮肤；(2)沿胸骨两侧第一根肋骨剪断，暴露肝脏；(3)打开腹腔，轻轻把肠道拉向躯体左侧，结扎输卵管静脉、胰十二指肠静脉；(4)于肠系膜后静脉下穿两条棉线，结扎远心端棉线，近心端棉线不结扎；(5)在两条棉线之间用眼科剪将肠系膜后静脉剪开一个小口，沿肝门静脉方向插 入小鼠灌胃针，并用近心端棉线结扎固定好灌胃针。所述肝脏的体内灌流的过程为(1)以30毫升每分钟的速度灌注40°C预热的无菌灌流液A，待肝脏鼓胀变为土黄 色时剪开上腔静脉，持续20分钟；(2)以30毫升每分钟的速度灌注40°C预热的无菌灌流液B，持续10分钟；(3)待流出的液体变清后，以20毫升每分钟的速度灌注42°C预热的无菌灌流液C， 15分钟后肝脏塌陷逐渐消化完毕。所述肝细胞洗涤的过程为(1)摘除灌好的肝脏，放入无菌平皿中，加入50毫升基础培养液，剔除血管、脂肪 和结缔组织，剪去肝脏周边消化不完全的部分；(2)用镊子撕开肝脏包膜，肝细胞会大量流出，大口径吸管轻轻吹打，随后分别过 100目(150微米)、200目(75微米)及400目(30微米)细胞筛，所得肝细胞悬液用基础培养液清洗，并以500转每分钟的速度离心5分钟，弃上清后在用基础培养液再清洗一次， 离心弃上清；(3)用贴壁培养液重悬，台盼蓝拒染法检测细胞活力、血细胞计数板计数；(4)细胞计数后，用贴壁培养液将细胞悬液稀释为IXlO6个细胞每毫升。以上所述的无菌灌流液A每升中含有2. 383克HEPES、8. 006克氯化钠、0. 224克 氯化钾、1.074克十二水合磷酸氢二钠、1.861克EDTA 二钠盐，余量为去离子水，pH值为 7. 4。以上所述的无菌灌流液B每升中含有2. 383克HEPES、8. 006克氯化钠、0. 224克 氯化钾、1. 074克十二水合磷酸氢二钠，余量为去离子水，pH值为7. 4。 以上所述的无菌灌流液C每升中含有0.4g II型胶原酶、2.383克HEPES、8.006克 氯化钠、0. 224克氯化钾、1. 074克十二水合磷酸氢二钠，0. 6克氯化钙，余量为去离子水。本专利技术在现有离体灌流分离蛋鸡肝细胞方法的基础上提出体内三步灌流方法，有 效的提高了分离肝细胞的数量和活率。具体实施例方式为进一步说明本专利技术的内容，以下通过具体方案进一步描述。本方案以产蛋高峰期蛋鸡肝脏30克为例分离制备肝细胞。首先在手术前蛋鸡禁食3小时，翅静脉注射4-5毫升肝素钠抗凝，腹腔注射5-10 毫升戊巴比妥钠麻醉。待鸡完全麻醉后，用38°C新洁尔灭溶液全身浸泡消毒，将消毒好的 鸡放入超净台，用无菌的工程线绑定翅膀和腿，仰卧固定在手术台上，从腹部中间起始，拨 开腹部和胸部皮肤；沿胸骨两侧第一根肋骨剪断，暴露肝脏；打开腹腔，轻轻把肠道拉向躯 体左侧，结扎输卵管静脉、胰十二指肠静脉；于肠系膜后静脉下穿两条棉线，结扎远心端棉 线，近心端棉线不结扎；在两条棉线之间用眼科剪将肠系膜后静脉剪开一个小口，沿肝门静 脉方向插入小鼠灌胃针，并用近心端棉线结扎固定好灌胃针。以30毫升每分钟的速度灌注 40°C预热的无菌灌流液A，待肝脏鼓胀变为土黄色时剪开上腔静脉，持续20分钟；以30毫 升每分钟的速度灌注40°C预热的无菌灌流液B，持续10分钟；待流出的液体变清后，以20 毫升每分钟的速度灌注42°C预热的无菌灌流液C，15分钟后肝脏塌陷逐渐消化完毕。摘除 灌好的肝脏，放入无菌平皿中，加入50毫升基础培养液，剔除血管、脂肪和结缔组织，剪去 肝脏周边消化不完全的部分；用镊子撕开肝脏包膜，肝细胞会大量流出，大口径吸管轻轻吹 打，随后分别过100目(150微米)、200目(75微米)及400目(30微米)细胞筛，所得肝 细胞悬液用基础培养液清洗，并以500转每分钟的速度离心5分钟，弃上清后在用基础培养 液再清洗一次，离心弃上清；用贴壁培养液重悬，台盼蓝拒染法检测细胞活力、血细胞计数 板计数；细胞计数后，用贴壁培养液将细胞悬液稀释为IX IO6个细胞每毫升。本专利技术制备的肝细胞与现有的离体灌流法制备的肝细胞相比较如下表所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋鸡肝细胞的制备方法，包括蛋鸡血管结扎、肝脏的体内灌流和肝细胞洗涤三个过程，其特征在于：所述蛋鸡血管结扎采用下述（１）－（５）过程：　　（１）将消毒麻醉好的蛋鸡放入超净台，从腹部中间起始，拨开腹部和胸部皮肤；　　（２）沿胸骨两侧第一根肋骨剪断，暴露肝脏；　　（３）打开腹腔，轻轻把肠道拉向躯体左侧，结扎输卵管静脉、胰十二指肠静脉；　　（４）于肠系膜后静脉下穿两条无菌棉线，结扎远心端棉线，近心端棉线不结扎；　　（５）在两条棉线之间用眼科剪将肠系膜后静脉剪开一个小口，沿肝门静脉方向插入无菌的小鼠灌胃针，并用近心端棉线结扎固定好灌胃针。

【技术特征摘要】
蛋鸡肝细胞的制备方法，包括蛋鸡血管结扎、肝脏的体内灌流和肝细胞洗涤三个过程，其特征在于所述蛋鸡血管结扎采用下述(1) (5)过程(1)将消毒麻醉好的蛋鸡放入超净台，从腹部中间起始，拨开腹部和胸部皮肤；(2)沿胸骨两侧第一根肋骨剪断，暴露肝脏；(3)打开腹腔，轻轻把肠道拉向躯体左侧，结扎输卵管静脉、胰十二指肠静脉；(4)于肠系膜后静脉下穿两条无菌棉线，结扎远心端棉线，近心端棉线不结扎；(5)在两条棉线之间用眼科剪将肠系膜后静脉剪开一个小口，沿肝门静脉方向插入无菌的小鼠灌胃针，并用近心端棉线结扎固定好灌胃针。2.按权利要求1所述蛋鸡肝细胞的制备方法，其特征在于所述肝脏的体内灌流的过 程为(1)以30毫升每分钟的速度灌注40°C预热的无菌灌流液A，待肝脏鼓胀变为土黄色时 剪开上腔静脉，持续20分钟；其中无菌灌流液A每升中含有-.2. 383克HEPES、8. 006克氯化 钠、0. 224克氯化钾、1. 074克十二水合磷酸氢二钠、1. 861克EDTA二钠盐，余量为去离子水， PH值为7.4;(2)以30毫升每分钟的速度灌注40°C预热的无菌灌流液B，持续10分钟；其中无菌灌 流液B每升中含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：董晓芳，佟建明，周筱丹，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]