本发明专利技术公开了布鲁氏菌的一种保护性抗原Ｏｍｐ２５ｃ蛋白及其在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。实验结果表明，与野生型疫苗株相比，ｏｍｐ２５ｃ突变株毒力减弱，说明ｏｍｐ２５ｃ基因在疫苗株的毒力中发挥一定的作用。ｏｍｐ２５ｃ缺失株诱导的体液和细胞免疫水平及免疫保护效果均下降，说明ｏｍｐ２５ｃ对疫苗株的免疫应答和免疫保护效果有促进作用。由此可见，Ｏｍｐ２５ｃ蛋白是布鲁氏菌的一个重要保护性抗原，能够增强疫苗株诱导的免疫反应及其保护效果，以其为活性成份制备布鲁氏菌疫苗，可提高疫苗的免疫保护效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白的新用途，特别是涉及布鲁氏菌疫苗株M5的重要免疫保护性抗 原0mp25c蛋白在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。
技术介绍
布鲁氏菌病(brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一类 动物源性疾病，是一种重要的人畜共患病，在世界范围内广泛流行。布鲁氏菌可感染人 类、多种家畜和野生动物，病人主要症状为慢性关节炎及神经损伤，病畜主要表现为流产 和不育(尚德秋.布氏菌病研究进展.中国地方病防治杂志2004，19 =204-212 ；Corbel, Μ. J. Brucellosis :an overview. Emerg Infect Dis 1997，3 :213-21.)。布病不仅给我国畜 牧业生产造成巨大的经济损失，也严重威胁人民的健康生活。另外，布鲁氏菌还被用作生物 武器，对国家安全存在着严重的威胁。近年来布病的发病率呈上升趋势，我国布病的发病率 已经超过历史最高水平，引起相关部门的高度重视。布鲁氏菌的外膜蛋白最早于20世纪80年代早期被发现，外膜蛋白在稳定细菌 外膜的结构、适应胞内外环境和抵抗胞内杀菌机制等方面起着重要作用，与布鲁氏菌的 毒力密切相关，同时也是免疫原性蛋白的重要来源(Schurig G G，Sriranganathan N， Corbel M J.Brucellosis vaccines :past,present and future. Vet Microbiol 2002,90 479-496.)。因此，很多有关布鲁氏菌致病机制和免疫反应机制的研究都集中在外膜蛋白 的研究上。Jos印h P. Connolly等在进行牛布鲁氏菌的免疫蛋白质组研究时，发现0mp25c 是牛布鲁氏菌的免疫原性蛋白(Connolly，J. P. et al. Proteomicanalysis of Brucella abortus cell envelope and identification of immunogeniccandidate proteins for vaccine development. Proteomics 2006.6:3767-80.)。但并非所有的免疫原性蛋白都具 有免疫保护性，如0!11 31，8 沈等免疫原性蛋白就没有免疫保护性。专利技术人在前期的羊布鲁 氏菌外膜蛋白质组研究中也发现，0mp25c蛋白是羊布鲁氏菌外膜蛋白的主要成员，但是该 蛋白在羊布鲁氏菌毒力和免疫保护性方面是否起着重要作用仍不清楚，专利技术人通过在疫苗 株中缺失omp25c并分析其毒力和免疫保护性的改变，来探讨omp25c蛋白在布鲁氏菌疫苗 中的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供0mp25c蛋白的一种新的医药用途。专利技术人的研究表明，0mp25c蛋白在布鲁氏菌疫苗的保护性中起着重要作用，具有 增强布鲁氏菌免疫保护性的作用，可以在制备布鲁氏菌疫苗中得到广泛应用。本专利技术所提供的布鲁氏菌疫苗的活性成份为上述可激发机体对布鲁氏菌产生免 疫力的保护性抗原0mp25c蛋白。免疫原性蛋白0mp25c在制备布鲁氏菌抗体的免疫保护性蛋白中的应用也属于本 专利技术的包括范围。本专利技术提供的免疫保护性抗原，可以在布鲁氏菌疫苗株高表达，从而进一步提高 疫苗的免疫保护效果。本专利技术提供一种0mp25c蛋白的新用途，即在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。为分析 0mp25c对布鲁氏菌疫苗株M5的毒力及免疫保护性的影响，本专利技术首先表达了 0mp25c蛋白， 确认它们的免疫原性，然后构建M5的omp25c基因缺失突变株，比较缺失突变株和疫苗株的 毒力和免疫保护性，对0mp25c蛋白的免疫保护性进行分析。与M5比较，omp25c突变株在小 鼠脾脏内的存活时间较短，在第4周时未能被检出。抗体水平检测结果表明，omp25c突变株 和M5疫苗株在Balb/c小鼠体内均能诱导产生特异性抗体，但是与M5相比，突变株引起的 体液免疫应答相对较弱，持续时间较短。而且突变株诱导产生反映体液免疫应答的细胞因 子IL-10的水平也远比M5低。突变株和M5疫苗株的小鼠脾淋巴细胞均能分泌IFN- γ，但 是突变株IFN-Y浓度明显低于疫苗株。免疫应答结果表明，突变株的体液和细胞免疫应答 能力明显下降，免疫原性减弱。攻毒实验结果表明，接种了 omp25c突变株的小鼠用16M攻 毒后，免疫保护效果下降，与M5疫苗株存在显著的差距。实验结果表明，与疫苗株M5相比， omp25c突变株毒力减弱，说明omp25c基因在M5疫苗株的毒力中发挥一定的作用。omp25c 的缺失使得M5诱导的体液和细胞免疫水平及免疫保护效果下降，说明omp25c对疫苗株M5 的免疫应答和免疫保护效果有一定的影响。由此可见，外膜蛋白0mp25c在布鲁氏菌疫苗株 M5的毒力和免疫保护性方面发挥重要的作用，是布鲁氏菌疫苗的关键成份，可以其为活性 成份制备布鲁氏菌疫苗。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。附图说明图1为重组蛋白0mp25c的SDS-PAGE检测结果图2为重组蛋白0mp25c的免疫原性分析结果图3为含突变盒N-K-C的重组质粒pUC19K-NC的1 %琼脂糖凝胶电泳检测结果图4为omp25c缺失突变株的PCR鉴定结果图5为omp25c缺失突变株在小鼠脾脏内的存活能力检测结果图6为小鼠血清总IgG水平检测结果图7为IFN-Y检测结果图8为IL-10检测结果图9为免疫保护实验结果具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。本专利技术中，0mp25c表示蛋白， 斜体小写omp25c表示基因。 实施例1、0mp25c蛋白的表达及免疫原性分析一、0mp25c蛋白的表达1、表达引物的设计B. melitensis 16M已完成全基因组测序，根据GenBank中收录的16M序列及注释 信息(GenBank号AE008918)，用SignalP软件分析基因的信号肽序列并去除相应的信号肽序列，DNAMar软件分析蛋白的抗原性及疏水性后，用I^rimer Premier 5 (PREMIERBiosoft International,Palo Alto)设计 0mp25c 蛋白的特异性表达引物BMEI18^-E_F :3，-ACGT GGATCCGACGCCGTCATTGAACAGG-5’ 和 BMEI1829-E-R 3’ -AGCTAAGCTTGAACTTGTAAGCGACACCG-5 ’。再根据表达载体PET3M的多克隆酶切位点信息在上游引物的5’端添加BamH I酶切位 点，在下游引物的5’端添加Hind III酶切位点。2、重组表达载体的构建以16M基因组为模板，使用上述引物BMEI18^-E-F和BMEI1829-E-R用PCR的 方法扩增omp25c基因。PCR反应体系为10XPCR缓冲液5μ 1，dNTP (2. 5mM) 4 μ 1，上游 引物(20 μ Μ) 0. 5 μ 1，下游引物(20 μ Μ) 0. 5ul，rTaq 酶(5U/y 1)0. 25 μ 1，模板 DNA(10ng/ μ 1)1 μ 1，加水补齐至终体积 50μ 1。PCR 反应条件为94°C 5min ；95°C 30s,56°C 30s， 72°C 60s本文档来自技高网...
【技术保护点】
Ｏｍｐ２５ｃ蛋白在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。
【技术特征摘要】
1.0mp25c蛋白在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：王玉飞，陈泽良，曲勍，钟志军，徐杰，汪舟佳，杜昕颖，孙岩松，黄留玉，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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