一步层析法从大肠杆菌中纯化Ｅｘｅｎｄｉｎ－４的工艺，它是按下述步骤进行的：（１）菌体裂解、（２）重组Ｅｘｅｎｄｉｎ－４吸附、（３）杂蛋白漂洗、（４）树脂平衡、（５）融合端切除及Ｅｘｅｎｄｉｎ－４收集、（６）Ｅｘｅｎｄｉｎ－４纯度及活性鉴定。由于本发明专利技术对蛋白质纯化步骤进行了革新，对相应的裂解液、洗液及平衡液的配方和用量进行了改进，省去了洗脱、透析及再次层析等步骤，增加了目的蛋白的产量和纯度。本发明专利技术和现有技术相比，简化了操作程序，操作步骤简便易行，适合工业化大批生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及Exendin-4的纯化工艺，具体涉及一种一步层析法从大肠杆菌中纯化 Exendin-4 的工艺。
技术介绍
Exendin-4是一种含39个氨基酸的活性调节肽，源于爬行动物的激素。Exendin-4 能通过以下多种机制降低血糖，改善糖尿病患者的病情1)刺激葡萄糖依赖的胰岛素分 泌，Exendin-4仅在高血糖时刺激胰岛素分泌，而在正常或低血糖水平不促进胰岛素分 泌，使Exendin-4更加安全；2)通过刺激β _细胞新生和增殖、抑制细胞凋亡等来改善胰 岛β-细胞量，从而阻止和逆转病情，使根治糖尿病成为可能；3)降低2-型糖尿病病人饥 饿感及餐后血循环中的胰高血糖素；4)调节葡萄糖在外周组织的转运。除了作用胰岛细 胞，该蛋白还能直接作用于肝脏和肌肉细胞，通过不依赖胰岛素的途径抑制糖原降解和促 进糖原合成，达到降血糖的作用；5)Exendin-4可以减缓胃排空、抑制食物吸收。而且由于 Exendin-4在体内的半衰期为9. 57小时，使其成为一种应用前景非常看好的新型2-型糖尿 病治疗药物，在同类药物中具有极强的竟争力。2004年美国Amylin公司首先化学合成了 Exendin-4,并获得专利，2005年在美国上市，2007年在英国上市，2009年5月在我国上市。 临床实验表明，Exendin-4能有效控制二甲双胍疗效不理想的2-型糖尿病，降低空腹及餐 后血糖浓度、糖化血红蛋白含量及体重，延缓疾病进程，延长寿命，提高生活质量，减少心血 管病发生；与其他同类治疗2-型糖尿病的药物相比，Exendin-4不仅副作用小，适合长期使 用，而且性价比比其他药物更高，经济实惠，适合大多数人使用。但是目前Exendin-4主要采用化学合成，成本高(对原料氨基酸及仪器设备要求 极高)、产量低，而且环境污染严重。利用基因工程生产Exendin-4，不仅可以实现工业化的 大规模生产、有效地降低产生成本，而且终产品污染各种有害化合物的机会极小，产品更加 安全。利用基因工程方法制备有经济价值的蛋白质成功的关键在于，其一是筛选高产菌株， 其二在于优化纯化方案，提高目的蛋白的纯度和产量。二者缺一不可。尤其是Exendin-4， 含39个氨基酸残基、分子量仅4. 2kD的小蛋白纯化难度更大。由于其极高的经济价值(7000 元/mg，2-型糖尿病治疗的特效新药)以及将来用于工业化生产，从大肠杆菌或大肠杆菌 中制备Exendin-4的纯化工艺极为重要，因为它决定了 Exendin-4的产量、纯度及工业化 生产的可行性。Xiaopu Yin等人曾将Exendin-4基因转化到大肠杆菌中，利用亲和层析及 高效液相层析得到纯度仅80 %的重组Exendin-4，但工艺复杂产量低，仅3. 14mg/kg细菌 (Protein Expression andPurification，2005，41 :259_265·)。 Jin Zhou 等(Biotechnol Lett, 2008, 30 :651-656)利用酵母生产重组 Exendin-4，采用超滤及 DEAE A_25、Phenyl FF、G-75、G-25四步层析法得到了纯度95. 6%的Exendin-4。这两种制备Exendin-4的方 法工艺复杂，要求的仪器设备昂贵，不仅成本高，而且多步骤不同缓冲体系的纯化可能改变 Exendin-4的空间结构，降低其生物活性，也不利于工业化大规模生产。我们采用一步层析 技术完成Exendin-4的纯化与制备，工艺及仪器设备要求都非常简单，为工业化大规模制备Exendin-4奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种一步层析法从大肠杆菌中纯化Exendin-4的工艺，用该工 艺能获得高纯度、高产量、高活性的Exendin-4。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的本专利技术的一步层析法从大肠杆菌中纯化Exendin-4的工艺，其特征在于它是按下 述步骤进行的(1)菌体裂解将_20°C保存的含重组Exendin-4的细菌于冰上融化后，每克细菌 用IOml裂解液悬浮沉淀，冰浴30min，超声波破碎；(2)重组Exendin-4吸附将上述裂解液于4°C，8000rpm离心30min ；将上清液与 树脂按2 1体积混合，4°C缓慢振荡吸附池；40C，3000rpm离心5min，弃去上清。本专利技术 所用的树脂为镍树脂。(3)杂蛋白漂洗在上述树脂中加入2. 5倍于裂解液的漂洗液，4°C缓慢振荡5min， 3000rpm离心5min，弃上清；再重复一次。(4)树脂平衡在上述树脂中加入2. 5倍于裂解液的平衡液，4°C缓慢振荡20min ； 40C，3000rpm离心5min，弃上清；再重复一次。(5)融合端切除及Exendin-4收集用与裂解液等体积的平衡液悬浮树脂，加 入IOU肠激酶，4°C缓慢摇动消化Mi ；静置30min后，3000rpm离心5min，上清液即纯化的 Exendin-4 溶液。(6) Exendin-4纯度及活性鉴定利用Ticin-SDS-PAGE鉴定Exendin-4的纯度，用 糖尿病小鼠鉴定Exendin-4的生物活性。步骤(1)中所用裂解液的组成为50mM NaH2P04、500mM NaCl、IOmM咪唑、0· 01 % Trition 100、2%甘油、IOmM β -巯基乙醇、0. 1 % PMSF、ImM MgCl2UU RNaseUU DNase。步骤(3)中所用的漂洗液组成为50mMNaH2PO4,500mM NaCl、20mM 咪唑，pH 8. 0o步骤(4)和步骤(5)中所用的平衡液的组成为50mM Tris-HCl ；ImMCaCl2 ；0. 1% Tween 20，ρΗ8· 0。由于本专利技术对蛋白质纯化步骤进行了革新，对相应的裂解液、洗液及平衡液的配 方和用量进行了改进，省去了洗脱、透析及再次层析等步骤，增加了目的蛋白的产量和纯 度。本专利技术和现有技术相比，简化了操作程序，操作步骤简便易行，适合工业化大批生产。附图说明图1是一步亲和层析分离纯化的Exendin-4 ；1 纯化的Exendin-4，2 :N端融合蛋白及树脂上吸附的杂蛋白。图2是Exendin-4的生物活性鉴定结果。具体实施例方式下面结合具体实施方式对本专利技术作详细说明。1.试剂的配制(1)裂解缓冲液IOOml的配置50mMNaH2P04 0 . 690g NaH2PO4 ‘ H2O (MW 137. 99g/mol)300mM NaCl 1. 754g NaCl(MW 58. 44g/mol)IOmM 咪唑0. 068g 咪唑(MW 68. 08g/mol)用NaOH 调 pH 至 8.0。现用现加Trition100，0. 01 % ；甘油，2 % ； β -巯基乙醇，IOmM ;PMSF，0. 1 % ； IOOmM MgCl2, ImM ；IOOmM MnCl2, ImM ；RNase, IU ；DNase, IU(2)漂洗缓冲液IOOml的配制50mM NaH2PO4O. 690g NaH2PO4 · H2O (MW 137. 99g/mol)300mM NaCl 1. 754g NaCl(MW 58. 44g/mol)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一步层析法从大肠杆菌中纯化Ｅｘｅｎｄｉｎ－４的工艺，其特征在于它是按下述步骤进行的：（１）菌体裂解：将－２０℃保存的含重组Ｅｘｅｎｄｉｎ－４的细菌于冰上融化后，每克细菌用１０ｍｌ裂解液悬浮沉淀，冰浴３０ｍｉｎ，超声波破碎；（２）重组Ｅｘｅｎｄｉｎ－４吸附：将上述裂解液于４℃，８０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ；将上清液与树脂按２∶１体积混合，４℃缓慢振荡吸附３ｈ；４℃，３０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃去上清；（３）杂蛋白漂洗：在上述树脂中加入２．５倍于裂解液的漂洗液，４℃缓慢振荡５ｍｉｎ，３０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃上清；再重复一次；（４）树脂平衡：在上述树脂中加入２．５倍于裂解液的平衡液，４℃缓慢振荡２０ｍｉｎ；４℃，３０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃上清；再重复一次；（５）融合端切除及Ｅｘｅｎｄｉｎ－４收集：用与裂解液等体积的平衡液悬浮树脂，加入１０Ｕ肠激酶，４℃缓慢摇动消化６ｈ；静置３０ｍｉｎ后，３０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，上清液即纯化的Ｅｘｅｎｄｉｎ－４溶液；（６）Ｅｘｅｎｄｉｎ－４纯度及活性鉴定：利用Ｔｉｃｉｎ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定Ｅｘｅｎｄｉｎ－４的纯度，用糖尿病小鼠鉴定Ｅｘｅｎｄｉｎ－４的生物活性。...
【技术特征摘要】
1.一步层析法从大肠杆菌中纯化Exendin-4的工艺，其特征在于它是按下述步骤进行的(1)菌体裂解将-20°C保存的含重组Exendin-4的细菌于冰上融化后，每克细菌用 IOml裂解液悬浮沉淀，冰浴30min，超声波破碎；(2)重组Exendin-4吸附将上述裂解液于4°C，8000rpm离心30min；将上清液与树脂 按2 1体积混合，40C缓慢振荡吸附汕；4°C，3000rpm离心5min，弃去上清；(3)杂蛋白漂洗在上述树脂中加入2.5倍于裂解液的漂洗液，4°C缓慢振荡5min， 3000rpm离心5min，弃上清；再重复一次；(4)树脂平衡在上述树脂中加入2.5倍于裂解液的平衡液，4°C缓慢振荡20min ；4°C, 3000rpm离心5min，弃上清；再重复一次；(5)融合端切除及Exendin-4收集用与裂解液等体积的平衡液悬浮树脂，加入IOU肠 激酶，4°C缓慢摇动消化Mi ；静置30min后，3000rpm离心5min，上清液即纯化的Exendin-4 溶液；...
【专利技术属性】
技术研发人员：王小纯，安帅，徐良，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：41
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