一种适用于ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ分析的番茄总ＲＮＡ提取方法技术

本发明专利技术提供了一种适用于ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ分析的番茄总ＲＮＡ提取方法。本方法特征在于通过８０℃预热的酚和ＴＬＥＳ缓冲液（１００ｍＭ三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ，ｐＨ?８．０）、１０ｍＭ氯化锂、１０ｍＭ乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）、１％十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ，ｗ／ｖ）），并结合异丙醇和乙酸钠／乙醇提取总ＲＮＡ，不仅能分离大片段ＲＮＡ，而且能够有效沉淀小分子ＲＮＡ。提取的ＲＮＡ质量高，完整性好，可以用于ＲＴ－ＰＣＲ、ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交等基因分离和表达分析，以及ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ等小分子ＲＮＡ的研究。该方法具有简单、廉价、高效、易于操作等优点，适合在分子生物学实验中使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物总RNA提取方法，特别是涉及到从番茄组织中提取总RNA的 方法。
技术介绍
RNA酶污染是造成RNA提取困难的主要原因之一，而RNA酶通常有两种来源，即外 源性RNA酶和内源性RNA酶。前者来自RNA制备过程的器皿、试剂和溶液、及研究人员本身 等，可以通过诸如DEPC水配制试剂和处理器皿，以及保持环境的清洁和操作人员勤换手套 等方式减少外源性RNA酶的影响。而内源性RNA酶是植物材料本身携带的，只有通过改善 提取方法本身进行克服。由于RNA酶的普遍存在及其高稳定性，往往给高质量RNA的分离 带来较大的困难。所以，建立良好的RNA提取技术是植物分子生物学研究的前提。番茄是 全世界最重要的蔬菜品种之一，同时也是植物分子生物学研究的重要模式植物，尤其在果 实发育与成熟调控分析中具有不可替代的地位。经过数年的发展，虽然已形成了一些番茄 总RNA的提取技术，如异硫氰酸胍法，但这些传统方法普遍对试剂和实验材料的用量大，成 本高，且操作稍有不慎，就会引起RNA的降解。尤其对于RNA需求量较少的实验常常造成实 验材料和试剂不必要的浪费。RNA提取试剂盒虽然具有优良的提取效果，如QIAGENE公司的 RNeasy Plant Mini Kit，但试剂盒昂贵的价格往往给研究工作带来较大的经济压力，难以 被普遍推广应用。MicroRNAs (miRNAs)是介于 21_25nt (nucleotides)的非编码内源 RNA，对真核生 物的基因表达具有非常重要的调控作用，是目前分子生物学的前沿和热点领域。在miRNA 研究中，高质量的RNA是miRNA杂交、定量PCR等分析的前提。由于miRNA的片段太短，在 基于离心柱吸附纯化方法的RNA提取过程中丢失严重，所以，TRIZOL(Invitrogen)和TRI试 剂(Sigma)等基于沉淀方式的提取技术被广泛应用于miRNA等小RNA分析的RNA分离。本专利技术的目的在于提供一种简单、经济、高效的番茄小量总RNA提取方法，为研究 人员在实际工作中提供更多的选择。所提取的RNA质量高，可以满足RT-PCR、Northern杂 交等基因分离和表达分析，以及microRNA研究的需要，同时可以大大降低实验的成本。
技术实现思路
为实现上述目的，本专利技术所采用的操作步骤为1)新鲜或冷冻保存的番茄组织材料于液氮中充分研磨成粉末状。2)在离心管中加入等体积的酚和TLES缓冲液，该缓冲液含有IOOmM三羟甲基氨 基甲烷(Tris，pH 8.0)、10mM氯化锂、IOmM乙二胺四乙酸(EDTA，pH 8.0)、和体积比为十二烷基硫酸钠(SDS)，于80°C充分预热。3)适量于液氮中研磨成粉的番茄植物材料转入至上述管中，并于80°C保温30s 后，剧烈涡旋Imin。4)然后加入1/2体积的氯仿/异戊醇，该混合液中两种成分的体积比为24 1，3充分涡旋混勻后，4°C，12，OOOg离心5min，将上清液转移入一新离心管中。 5)再用等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24 1)抽提一次，上清液转至一新离 心管，加入等体积的异丙醇，室温沉淀30min后，4°C，12，OOOg离心lOmin，去除上清液。 6)沉淀溶解于适量DEPC水中，再加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的无 水乙醇，_80°C沉淀Ih或-20°C过夜后，4°C，12，OOOg离心30min，去除上清液。7)RNA沉淀经70%乙醇洗两次后，干燥，溶于适量DEPC水中，-20°C保存备用。“”的专利技术优点在于，可对番茄 组织的RNA进行小量提取，大大节约实验成本。例如，酚和TLES缓冲液分别500 μ L的使用 量可有效提取0. 04-0. IOg番茄叶片的总RNA(表1，附附图说明图1)，0D26(1/28(1为1. 8左右，说明提取 的RNA纯度较高。该专利技术方法提取的得率虽然略低于TRIZOLdnvitrogen公司)，但完全可 以满足分子生物学研究的需求。同时该专利技术方法还可以有效沉淀小片段RNA，所提取的RNA 不仅可以用于基因分离及表达分析，而且可应用于microRNAs等小分子RNA的研究(附图 2)。表1总RNA的纯度和得率本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
一种适用于microRNAs分析的番茄总RNA提取方法，其特征在于以下操作a、在离心管中加入等体积的酚和TLES缓冲液(100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris，pH 8.0)、10mM氯化锂、10mM乙二胺四乙酸(EDTA，pH 8.0)、1％十二烷基硫酸钠(SDS，w/v))，并于80℃充分预热；b、适量于液氮中研磨成粉的番茄植物材料转入至上述管中，并于80℃保温30s后，剧烈涡旋1min，然后加入1/2体积的氯仿/异戊醇(24∶1)(TLES∶酚∶氯仿∶异戊醇，25∶25∶24∶1)，充分涡旋混匀后，4℃，12,000g离心5min，将上清液转移入一新离心管中；c、再用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次，上清液转至一新离心管，加入等体积的异丙醇，室温沉淀30min后，4℃，12,000g离心10min，去除上清液；d、沉淀溶解于适量DEPC水中，再加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的无水乙醇， 80℃沉淀1h或 20℃过夜后，4℃，1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨迎伍，李正国，吴玉，邓伟，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：85