一种与妊娠期糖尿病相关的血清／血浆ｍｉＲＮＡ标志物及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程及生殖医学领域，涉及一种与妊娠期糖尿病相关的血清／血浆ｍｉＲＮＡ标志物及其应用。该标志物为ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－２９ａ和ｍｉＲ－２２２的组合。该标志物及其引物可用于制备诊断试剂盒，用于妊娠期糖尿病的辅助早期诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种与妊娠期糖尿病相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用专利
本专利技术属于基因工程及生殖医学领域，涉及一种与妊娠期糖尿病相关的血清/血 浆miRNA标志物及其应用。
技术介绍
妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期发生或首次发 现的不同程度的葡萄糖耐量异常，若发生在妊娠早期不排除葡萄糖耐量异常在妊娠前就已 经存在的可能性。GDM是最常见的妊娠期合并症之一，约有3% -8%的孕妇在妊娠期间出现 GDM，尤为值得关注的是，随着育龄妇女肥胖率的增加，GDM的发生率不断上升。GDM可给母体及胎儿带来一系列的并发症，如增加自然流产发生率、妊娠高血压综 合征、羊水过多等，也增加了巨大儿、胎儿发育异常、胎儿宫内窘迫、死胎、死产发生率；并使 新生儿易发生低血糖症、高胆红素血症，呼吸窘迫综合征、红细胞增多症等。如果不及时进 行诊断和治疗，不仅孕产妇及胎婴儿患病率和病死率将明显上升，产妇及其后代远期糖尿 病患病率也将上升。因此，早期诊断、早期干预、及时合理治疗是预防GDM、减少母婴合并症 的关键，是亟待解决的重大科学问题。目前国际上对GDM的筛查和诊断方法及标准尚未完全统一，通常GDM需在第2孕 期晚期或第3孕期才能进行诊断，根据美国糖尿病协会(American Diabetes Association, ADA)禾口美国妇产禾斗学会(American College of Obstetricians and Gynecologists, AC0G)指南，GDM的血清学筛查在对-观孕周进行，这样可用于干预时间少之又少。因此，我 们亟需发现更加明确而有效的生物标志物，对GDM做出辅助早期诊断，这将有助于早期干 预，减少不良妊娠结局。MicroRNAs (即miRNAs)是近年来分子生物学研究领域的一个热点，它的成熟状态 是一类长约19-23个核苷酸的小单链RNA分子，进化上具有高度保守性。MiRNA的主要功 能是调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达。自从参与调 控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA分别在2002年和2003年两度入选 Science杂志年度十大科技突破。2005年预测miRNAs至少能调控5300个人类基因，即所 有基因的30%。随着研究的深入，越来越多的miRNAs不断被发现。聚光灯下的miRNA已经 逐步摆脱了 DNA光芒的掩盖，从“配角”变成“主角”，并且对DNA的中心地位提出了新的挑 战。近年来，miRNA与疾病的关系已经成为研究的热点和重点，已经发现miRNA通过负调控 基因的表达与肿瘤，糖尿病等，心脏病的发病高度相关。研究已经证实血清/血浆中存在几百种的miRNAs，这些小分子RNAs性质稳定、 含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性。现有的成熟的技术，包括定性和定量 miRNA分子的技术，表明利用血清miRNAs作为分子生物标志物的方法比传统的特异蛋白分 子标记方法将更加有效，为生物标志物开拓了新境界。然而，目前还没有用于GDM辅助早期诊断的较为稳定的生物标志物的报道，若能筛选出GDM特异或异常表达的血清/血浆miRNAs作为生物标志物，并研制相应的辅助早期 诊断试剂盒，对我国GDM的诊断现状必将是一次有力的推动。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与GDM相关的血清/血浆miRNA 标志物。本专利技术的第二个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物的引物。本专利技术的第三个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物及其引物在制备GDM辅 助早期诊断试剂盒中的应用。本专利技术第四个目的是提供用于GDM辅助早期诊断的试剂盒。专利技术人通过分离和研究GDM病例发病前及与其年龄匹配的健康孕妇对照血清/血 浆中的miRNAs，寻找一组与GDM发病高度相关的高特异性和敏感性的miRNAs，并研制出可 便于临床应用的GDM辅助早期诊断试剂盒，为GDM的筛查和早期诊断提供数据支持，为GDM 的干预提供数据支持。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的一种与GDM相关的血清/血浆miRNA标志物，该标志物为miR-132、miR-29a和 miR-222的组合。所述的血清/血浆miRNA标志物的引物，这些引物为miR_132的引物为SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 ;miR-29a 的引物为 SEQ ID No. 7 和 SEQ IDNo. 8 ;miR_222 的引物为 SEQ ID No. 11和 SEQ ID No. 12。所述血清/血浆miRNA标志物在制备GDM辅助早期诊断试剂盒中的应用。所述血清/血浆miRNA标志物的引物在制备GDM辅助早期诊断试剂盒中的应用。一种GDM辅助早期诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清/血浆中miRNA中 miR-132、miR-29a 和 miR-222。所述诊断试剂盒，该试剂盒含有血清/血浆中miRNA中miR-132、miR-29a和 miR-222的引物。所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的血清/血浆miRNA标志物的引物为miR_132 的引物为 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 ;miR_29a 的引物为 SEQ ID No. 7 和 SEQ IDNo. 8 ； miR-222 的引物为 SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12。所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶，缓冲液， dNTPs, MgCl2, DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。具体地说，本专利技术解决问题的技术方案包括(1)建立统一标准的标本库和数据 库以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床 资料。( 血清/血浆miRNA差异表达谱分析选择GDM病例、与GDM病例年龄匹配的健康 女性对照，检测病例及对照16-19孕周血清/血浆miRNA表达谱及含量，分析GDM病例在 发病前和健康女性对照间血清/血浆miRNA的共性和特性，筛选差异表达miRNAs，进行进 一步多阶段验证。( 筛选疾病特异血清/血浆miRNAs 对已筛选的血清/血浆差异表达 miRNAs在大样本人群中进行定量分析，确定GDM特异性血清/血浆miRNAs (4)血清/血浆 miRNA筛查和辅助早期诊断试剂盒的研制根据GDM病例和健康女性对照的特异血清/血4浆miRNA开发miRNAs诊断试剂盒。本专利技术人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口 学资料、临床资料等(这些资料可用于判断疾病进展，患者年龄等因素对于发病的影响)， 并采用了 RT-PCR、Real-time PCR 方法、iTaciMan Low Density Array (TLDA)芯片检测等。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分1.研究样本的选择(1)采集16-19孕周的健康孕妇的血清(2)上述研究对象在M-观孕周GDM筛查时经OGTT确诊为GDM的孕妇定义为病例(3)上述研究对象在M-观孕周GDM筛查时未发生GDM，与病例年龄、BMI、孕周匹 配的健康孕妇定义为对照本研究共采用120例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与妊娠期糖尿病相关的血清／血浆ｍｉＲＮＡ标志物，其特征在于该标志物为ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－２９ａ和ｍｉＲ－２２２的组合。

【技术特征摘要】
1.一种与妊娠期糖尿病相关的血清/血浆HiiRNA标志物，其特征在于该标志物为 miR-132,miR-29a 和 miR-222 的组合。2.权利要求1所述的血清/血浆miRNA标志物的引物，其特征在于该引物为 miR-132 的引物为 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 ;miR_29a 的引物为 SEQ ID No. 7 和SEQID No. 8 ；miR-222 的引物为 SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12。3.权利要求1所述的血清/血浆miRNA标志物在制备妊娠期糖尿病辅助早期诊断试剂 盒中的应用。4.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：沙家豪，胡志斌，赵纯，潘世扬，董静，石中华，霍然，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]