一种自然水环境中的溶藻菌分离方法技术

本发明专利技术提供了一种自然水环境中的溶藻菌分离方法，属于自然水环境的生物控藻技术。本发明专利技术采用自然水环境挂膜的方法，通过在富营养化水体中放置惰性载体，在短时间内形成物种丰富的微生物群落，然后采用添加了藻类细胞内含物的固体ＳＭ培养基进行高效溶藻细菌的筛选分离。本发明专利技术能够快速、便捷、有效地分离高效的溶藻菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于自然水环境的生物控藻技术，具体涉及一种自然水环境中的溶藻菌分 离方法。
技术介绍
20世纪60年代，国外科学家发现有多种微生物着生在水华藻类上并能分解 藻类，揭开了微生物与水华之间的关系，并开始了有关病毒(Curtis A. Suttle, Α. Μ. C, Matthew Τ.Cottrel1. Infection of phytoplankton by viruses and reduction of primary productivity [J]. Nature ,1990,347: 467-469.)、真菌(Ellen Van Donk, J. R. The effect of fungal parasitism on the succession of diatoms in Lake Maarsseveen I (The Netherlands) [J]. Freshwater Biology, 1983, 13(3) : 241-251.)以及细菌溶藻 的研究。后来越来越多的研究发现溶藻细菌对水华的控制有非常重要的作用。然而，溶藻细 菌控藻研究首先就是要从自然水体中分离高效溶藻细菌。针对目前溶藻细菌的分离方法， 通常分为两种思路一种是利用液体感染的方法进行分离；另一种是利用固体感染的方法 进行分离。具体分离方法为(1)利用液体感染筛选分离方法利用液体感染方法筛选溶藻细菌，一般先确定水样中是否含有溶藻细菌，再进行分 离蹄选。(Imai I, Kim Mu-Chan, et al. Relationships between dynamics of red tide-causing raphidophycean flagellates and algicidal micro-organisms in the coastal sea of Japan [J]. Phycological Research, 1998，46 (2) : 139-146.)展了一种 利用液体培养基分离海洋溶藻细菌的方法。程序如下采集水样，经0. 8 m滤膜过滤，去除 比细菌大的颗粒，然后用藻类培养基对水样进行10倍递增梯度稀释，取ImL各个稀释度的 水样分别加入4mL预培养藻类培养物中，设置5个平行进行培养。培养一段时间后，取黄化 的培养物涂布平板分离细菌，然后从优势菌株筛选溶藻细菌。(2)固体感染筛选方法(即软琼脂顶层平板法(SAOTL))在固体培养基上分离溶藻细菌主要利用空斑形成(Plaque formation)的方法进行。 1964年Safferman(Safferman R. S, Camion R. Ε, Desjardins P. R, et al. Classification and nomenclature of viruses of cyanobaeteria[J]. Intevrirology, 1983, 19:61-66.) 首先采用SAOTL法分离和检测蓝藻病毒，1970年Shilo (Shilo M. Lysis of Blue-Green Algae by Myxobacter. Journal of bacteriology, 1970, 104(1) : 453-461.)将其用于分离 溶藻细菌，后经过许多研究者的不断发展和完善，目前以成为一种分离溶藻微生物，尤其是 淡水生态系统中溶藻细菌的常用方法(Kurhmaro A , Loya Y, et al.Bacterial infection and coral bleaching [J]. Nature, 1996，380:396.)其基本操作如下制备两种藻类固体 培养基一琼脂培养基和软琼脂培养基(soft-agar medium)，以琼脂培养基作底层平板， 水样、预培养的藻和融化并冷却到47°C的软琼脂培养基混合均勻迅速倾注到底层平板，琼 脂固化后进行培养，至扩散的溶藻斑出现后，通过单斑纯化获得溶藻菌株(席宇，一株欧文氏菌的分离及其溶藻特性的研究.2003，华中师范大学.硕士毕业论文)。由于水样的预处理、微生物间相互依赖关系以及分离使用的培养基缺乏微生物 所需的特殊的营养需求等，种种这些原因都会使大部分的细菌被遗漏，无论在液体还是 在固体培养基中，有些细菌是不能被分离培养的。Suzuki (Suzuki M Τ, M S Rappe, Z W Haimberger. Bacterial diversity among small—subunit rRNA gene clones and cellular isolates from the same seawater sample[J]. App1. Environ. Microbiol., 1997，63 (3) : 983-989.)的研究发现在海洋环境中，通过培养获得细菌的16SrRNA序列 远远少于直接从环境中获得的序列。这给分离高效溶藻微生物带来了困难，这些矛盾的解 决都需要技术和方法上的突破。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，可直观、快速、便捷 地分离具有高效抑藻效果的溶藻细菌。本专利技术的技术方案如下，包括如下步骤1)在富营养化水体中放置惰性载体，在惰性载体上形成富集多种微生物的生物膜；2)制备藻类细胞内含液，将其与BGll培育基混合后制成半固体培养基，铺在BGll固 体培养基上，获得SM培养基；3)清洗步骤1)形成的生物膜材料，去除原生动物和水中杂质，然后加入藻类培养液中 培养；4)取步骤3)中发生溶藻现象的培养液进一步在固体培养基上进行溶藻空斑实验；5)挑取步骤4)形成的溶藻空斑再进行多次溶藻空斑实验，从而纯化空斑；6)取纯化后的空斑在步骤2)制备的SM培养基上划线培养，获得单菌落并检测其溶藻 效果，得到溶藻菌。上述步骤1)中所述惰性载体是惰性挂膜材料，可选用惰性玻璃片、FPUFS载体(含 有羟基、环氧基和酰胺基等反应性基团，孔径0. 3 0. 7mm)等。惰性挂膜材料通常垂挂在 富营养化水体水面下广1. 5m处，15-30天后即可得到富集多种微生物的生物膜。通过在不同地域如云南滇池、北京的富营养化湖泊、富营养化景观水体中放置多 个惰性挂膜材料，定期采收形成生物膜的材料开展后续的溶藻试验初步筛选，再从有明显 控藻效果生物膜中分离溶藻微生物。上述步骤2)中所述藻类根据待治理区域的水华特点进行选择。针对我国水华特 点主要为微囊藻、水华鱼腥藻(Jfla如ma卯ae)，可建立以这两种藻类细胞内含液与 BGll培养基混合制作的SM培养基，直接用于溶藻菌的分离，能快速完成针对微囊藻、水华 鱼腥藻等水华藻的溶藻菌的筛选。可以通过将藻类细胞反复冻溶后离心，取上清过滤除菌 得到无菌的藻类细胞内含液。上述步骤3 )通常是将生物膜材料用灭菌高纯水清洗后，将清洗得到的混合液通过 滤纸过滤，以消除原生动物的影响以及去除水中的杂质；然后将滤液加入预培养的藻类培 养液中，光照静置培养，出现溶藻现象的培养液用于下一步骤。上述步骤4)的溶藻空斑实验所用的培养基为BGll固体培养基，将步骤3)出现溶 藻现象的培养液用BGll培养液稀释后与浓缩的藻液混勻，涂布在BGll固本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自然水环境中的溶藻菌分离方法，包括如下步骤：　　１）在富营养化水体中放置惰性载体，在惰性载体上形成富集多种微生物的生物膜；　　２）制备藻类细胞内含液，将其与ＢＧ１１培养基混合后制成半固体培养基，铺在ＢＧ１１　固体培养基上，获得ＳＭ培养基；　　３）清洗步骤１）形成的生物膜材料，去除原生动物和水中杂质，然后加入藻类培养液中培养；　　４）取步骤３）中发生溶藻现象的培养液进一步在固体培养基上进行溶藻空斑实验；　　５）挑取步骤４）形成的溶藻空斑再进行多次溶藻空斑实验以纯化空斑；６）取纯化后的空斑在步骤２）制备的ＳＭ培养基上划线培养，获得单菌落并检测其溶藻效果，得到溶藻菌。

【技术特征摘要】
一种自然水环境中的溶藻菌分离方法，包括如下步骤1)在富营养化水体中放置惰性载体，在惰性载体上形成富集多种微生物的生物膜；2)制备藻类细胞内含液，将其与BG11培养基混合后制成半固体培养基，铺在BG11 固体培养基上，获得SM培养基；3)清洗步骤1)形成的生物膜材料，去除原生动物和水中杂质，然后加入藻类培养液中培养；4)取步骤3)中发生溶藻现象的培养液进一步在固体培养基上进行溶藻空斑实验；5)挑取步骤4)形成的溶藻空斑再进行多次溶藻空斑实验以纯化空斑；6)取纯化后的空斑在步骤2)制备的SM培养基上划线培养，获得单菌落并检测其溶藻效果，得到溶藻菌。2.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤1)中所述 惰性载体为惰性玻璃片或FPUFS载体。3.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤1)将所述 惰性载体垂挂在富营养化水体水面下广1. 5m处15-30天。4.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤2)中所述 藻类为微囊藻和/或水华鱼腥藻。5.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴为中，李超，吴伟龙，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]