本发明专利技术涉及一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶Ｂ及其生产方法，属于酶基因工程和酶工程领域。该磷脂酶Ｂ由荧光假单胞菌产生，其基因全长１２７２ｂｐ，编码４２３个氨基酸，酶蛋白理论分子量为４５．８ｋＤａ，其中１～６９ｂｐ编码磷脂酶Ｂ信号肽，７０～１２７２ｂｐ编码磷脂酶Ｂ成熟肽。利用现有分子生物学方法可以得到其表达载体和重组宿主，即获得含有磷脂酶Ｂ基因的大肠杆菌重组质粒以及重组大肠杆菌。本发明专利技术的磷脂酶Ｂ在低温下具有良好的活性和稳定性，并且无脂肪酶的活性，能够水解催化完整磷脂中的两个脂酰基基团，在油脂精炼和修饰磷脂乳化剂等工业过程中有着广泛的应用，制备方法简单、产品质量高、生产成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法，属于酶基因工程 和酶工程领域。
技术介绍
磷脂在自然界分布广泛，所有的细胞中都含有磷脂，磷脂是生物膜的基本组成成 分。磷脂在生命过程中起代谢作用和结构形成作用，是重要的生命物质。磷脂酶是水解磷 脂的酯键的酶，广泛存在于真核生物和原核生物中，影响磷脂的分解代谢、生物膜的形成和 重组，并且磷脂酶也涉及信号的级联。依据其作用位点不同，磷脂酶分为磷脂酶Ai、A2、B、C、 D等。其中磷脂酶~和^分别水解Sn-1和Sn-2位酰基，产生溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶 B具有水解酶和溶血磷脂酶的活性。水解酶的活性能同时水解Sn-1和Sn-2位酰基，溶血磷 脂酶的活性则能水解溶血磷脂剩余的酰基。磷脂酶在工业中有多种应用，包括应用于食品和非食品的磷脂乳化剂的修饰，增 加油/水混合物的乳化；磷脂酶可用于植物油加工过程中的酶法脱胶；淀粉水解产物(特 别是小麦淀粉的水解产物)的后续处理以提高过滤通透能力。此外，磷脂酶在烘焙应用中 对于提高生面团或烘焙产品质量特别有效。低温磷脂酶B的最适酶活温度一般在40°C以 下，它具有最适酶活温度低，在低温下具有更高的催化效率等特点，因而应用于植物油酶法 脱胶和修饰磷脂乳化剂等工业生产中可简化生产工艺、节能减耗、提高产品质量、保护环 境、降低生产成本。磷脂酶B已从动物、植物、微生物等不同的来源获得。动物包括天竺鼠 [A.Gassama-Diagne 等，(J. Biol. Chem.)，264，9470-9475，1989]；老鼠[S. Pind et al.， (Biochem. Cell. Biol. )，69，346-357，1991]；兔子[ff. Boll et al.，(J. Biol. Chem. )，268， 12901-12911,1993] o 植物有蚕豆[Y.Lee et al.，(FEBS Lett. )，343，213-218，2001]。微 生物包括酿酒酵母[M. Ichimasa et al.，(Agric. Biol. Chem.)，49 (4)，1083-1089，1985 ； F. Paultaufet al.，(J. Biol. Chem. )，269，19725-19730，1994]；粟酒裂殖酵母[H. Oishi. et al.，(Biosci. Biotech. Biochem.) ,60(7)，1087-1092，1996]；产黄青霉[N. Kawasaki, et al.， (J. Biol. Chem.) ,77,1233—1244，1975 ；N. Masuda. etal.，(Eur. J. Biochem.) ,202, 783—787， 1991]；牛莫氏杆菌[J. M. Tennent et al.，(J. Bacteriol.), 183,6717-6720,2001]；鼠麻风分 支杆菌[Shinji Mae da et al. , (Biochimica et Biophysica Acta), 1303,31-38,1996]。但 动植物磷脂酶B来源有限，且价格昂贵。微生物磷脂酶B的研究发现为磷脂酶的应用提供了 新的来源，并且其发酵条件简单，大大降低了生产成本，为以后的工业化生产奠定了基础。到 目前为止，有关产生低温磷脂酶B的荧光假单胞菌的研究，国内外尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法，该 磷脂酶B在低温下显示活性，并且无脂肪酶的活性，能够水解催化完整磷脂中的两个脂酰基基团，该方法简单、产品质量高、生产成本低。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的。本专利技术的一种来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas f luorescens)的磷脂酶B，该 磷脂酶B由荧光假单胞菌产生，磷脂酶B在低温下具有良好的活性和稳定性。磷脂酶B基 因全长1272bp，编码423个氨基酸，酶蛋白理论分子量为45. 8kDa，其中1 69bp编码磷脂 酶B信号肽，70 1272bp编码磷脂酶B成熟肽；利用现有分子生物学方法可以得到其表达 载体和重组宿主，即获得含有磷脂酶B基因的大肠杆菌重组质粒以及重组大肠杆菌。本专利技术的一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B的生产方法，在合适的发酵培养基 中培养可产生磷脂酶B的荧光假单胞菌株系。通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化， 选用廉价普通的营养成分，采用常规单批发酵方式，磷脂酶B发酵酶活达43. 2U. mL-1.,其中 发酵培养基为终浓度百分含量(g/mL)0. 01 5%大豆磷脂，0. 1 10%淀粉，0. 01 5% 牛肉膏，0. 01 5%蛋白胨，0. 01 3% NaCl，0. 01 2% MgS04 7H20，调 pH3. 0 11. 0。 通过SDS-PAGE以及从荧光假单胞菌克隆到磷脂酶B基因，进一步确定了菌株BIT-18只产 生磷脂酶B，无脂肪酶活性。有益效果本专利技术的磷脂酶基因B在低温下显示活性，并且无脂肪酶的活性，能够水解催化 完整磷脂中的两个脂酰基基团，在油脂精炼和修饰磷脂乳化剂等工业过程中有着广泛的应 用，本专利技术的制备方法简单、产品质量高、生产成本低。附图说明图1为棕榈酸甲酯的标准品气相色谱图；图2为油酸甲酯的标准品气相色谱图；图3为荧光假单胞菌BIT-18表达磷脂酶的气相色谱鉴定图；图4为磷脂酶B温度变化曲线；图5为磷脂酶B pH值变化曲线；图6为PCR扩增荧光假单胞菌BIT-18的磷脂酶B基因保守片段的琼脂糖凝胶 电泳；其中M表示DL2000Marker，1表示单引物PLB-1PCR产物，2表示双引物PLB-1和 PLB-2PCR产物，3单引物PLB-2PCR产物；图7为PCR扩增荧光假单胞菌BIT-18的磷脂酶B全长基因的琼脂糖凝胶电泳；其 中M表示DL2000Marker，1表示磷脂酶B全长基因PCR产物；图8为大肠杆菌重组质粒pET28a(+)-plb单酶切和双酶切图；其中M表示 lkbMarker, 1表示EcoRI和Hind III双酶切，2表示EcoRI单酶切，3表示Hindlll单酶切；图9为在大肠杆菌中表达的磷脂酶B的SDS-PAGE ；其中M表示蛋白Marker，1和6 表示荧光假单胞菌BIT-18表达的磷脂酶B，2表示重组大肠杆菌BL21 (DE3)诱导前全细胞， 3表示重组大肠杆菌BL21(DE3)诱导后全细胞，4 表示重组大肠杆菌BL21 (DE3)的周质部 分，5表示重组大肠杆菌BL21(DE3)的上清部分。具体实施例方式实施例1 一、产生磷脂酶菌株的筛选1、菌种的分离筛选采自新疆维吾尔自治区石河子市、山西省大同市、运城市、河南省郑州市，其中包 括大豆油、菜籽油、棉籽油加工车间周围及大豆和菜籽种植基地的土样，均为地表以下10cm 处采集，共18份。取土样10g，放入盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶，室温振荡 12h后静置。吸取lmL上层液体接种于49mL富集培养基(大豆磷脂4. Og/L, KN031. Og/L, K2HP041. Og/L, NaCl 0. 5g/L，MgS04 7H20 0. 5g/L)中，30°C摇瓶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种磷脂酶Ｂ，其能够水解磷脂中的两个脂酰基基团，其特征在于：来源于荧光假单胞菌的一个株系。
【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶B，其能够水解磷脂中的两个脂酰基基团，其特征在于来源于荧光假单 胞菌的一个株系。2.根据权利要求1所述的一种磷脂酶B，其特性在于荧光假单胞菌的一个株系为 BIT-18，其 GenBank 号为 GU367870。3.根据权利要求1所述的一种磷脂酶B，其特性在于由423个氨基酸组成，酶蛋白理 论分子量为45. 8kDa。4.根据权利要求3所述的一种磷脂酶B，其特性在于423个氨基酸包含与序列SEQ NO. 2所示氨基酸序列有至少90%同源性的氨基酸序列，且能够水解磷脂中的两个脂酰基基团。5.根据权利要求3所述的一种磷脂酶B，其特性在于423个氨基酸包含的N端氨基酸 序列是序列SEQ NO. 2的第1-423位所示序列。6.根据权利要求3所述的一种磷脂酶B，其特性在于423个氨基酸所对应的核苷酸序 列为SEQ NO. 1，全长为1272bp，其中1 69bp编码磷脂酶信号肽，70 1272bp编码磷脂酶 成熟肽。7.一种磷脂酶B的生产方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：李春，姜芳燕，王金梅，戴大章，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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