一种包裹大分子药物的纳米型脂质体的制备方法技术

本发明专利技术公开了包裹大分子药物的纳米型脂质体的制备方法，其步骤为将卵磷脂、ＣａＣｌ↓［２］和大分子药物于生理盐水搅拌混匀，并在４℃下对混合液交替进行超声波振荡和静置，直至得到脂质体悬液，然后通过离心收集获得包裹大分子药物的纳米型脂质体。本发明专利技术具有以下优点：制得的纳米型脂质体对内包药物的包封率为４５％，并可以在２０ｍｉｎ内即有效投递内包药物到细胞内，药物被投递到细胞后从脂质球中释放出来。同时，脂质体原液配方中不含任何不明或细胞毒性物质，制备获得的纳米脂质体对细胞没有任何毒害作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及试验室研究和临床治疗中的给药领域，专利技术提供了一种能够快速，高效投递难透膜药物进入细胞的给药方法。
技术介绍
试验室研究中，很多纯化获得的生物活性物质如藻蓝蛋白，超氧化物歧化酶，异硫氰酸荧光素(FITC)等不能有效进入细胞内部，这阻碍了对其的生物学活性的进一步研究；临床上，大多数肿瘤治疗药物如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，以下简称SOD)等必须进入细胞内部，才能发挥其生物学作用，天然SOD由于其分子量较大而基本不能穿透细胞膜，这导致了SOD的给药量增加，容易造成过敏性反应和毒副作用。卵磷脂是一种脂溶性物质，它所形成的球状脂质体具有生物膜的特征，可以有效透过细胞膜，并在细胞内形成一个缓释的药库，有效提高内包物质的半衰期。
技术实现思路
针对现有临床或研究试验中给药中存在的不足之处，本专利技术的目的是提供一种能快速，高效投递大分子药物到细胞内部的纳米脂质体的制备方法。本专利技术提供的包裹大分子药物的纳米型脂质体的制备方法，依次包括以下步骤(1)将卵磷脂、CaCl2和大分子药物于生理盐水搅拌混匀，4℃下静置，卵磷脂、CaCl2和大分子药物的质量比为20∶10∶0.5～1；(2)4℃下，对上述混合液交替进行超声波振荡和静置，直至得到脂质体悬液；(3)1000～2000rpm离心脂质体悬液，收集上清；30000～50000rpm离心上清液，沉积于底部的即为脂质体小囊，PBS缓冲液洗涤脂质体小囊并溶于PBS缓冲液中，得到包裹大分子药物的纳米型脂质体。上述的大分子药物是任何透膜能力差的物质，如超氧化物歧化酶或者藻蓝蛋白。采用超声波振荡的功率一般为400W～800W。包裹大分子药物的纳米型脂质体的细胞给药方法(1)接种细胞(悬浮或贴壁细胞均可，细胞密度为5×105个/ml培养基)于无血清培养基中，加入20％体积的脂质体药物，37℃二氧化碳(5％)培养箱中孵育1h，期间晃动细胞几次。(3)PBS洗涤细胞两次，除去胞外未结合脂质体。本专利技术与现有技术相比具有以下优点(1)包裹大分子药物的纳米型脂质体，直径为90～110nm，对内包药物(如SOD)的包封率为45％。(2)制备获得脂质体能在20min内即有效投递内包药物到细胞内。(3)药物被投递到细胞后从脂质球中释放出来，进而发挥其药效，(4)脂质体原液配方中不含任何不明或细胞毒性物质，制备获得的纳米脂质体对细胞没有任何毒害作用。附图说明图1是400w和800w超声波功率下制备获得脂质体颗粒的直径分布曲线；图2是脂质体投递荧光药物的时间依赖性效果，图a，b，c分别为包裹FITC的脂质体孵育细胞0min，20min，60min后的图片。脂质体内包的FITC的激发光波长和发射光波长分别为488nm和520nm；图3是双重荧光探针标记的脂质体对SPC-A-1肺癌细胞投递后的单个细胞的示意图，图A、B、C、D分别为此细胞在各种不同激发波长下的显微图片。具体实施例方式以下通过实例进一步对本专利技术进行描述实施例1、FITC荧光脂质体的制备(1)混合100mg卵磷脂，46mg CaCl2，10mg FITC(发绿色荧光的水溶性分子探针，能自发分布于脂质体微球内部)于20ml生理盐水，搅拌混匀，4℃下放置30min；(2)4℃下，800W超声波振荡脂质体原液，每次超声波持续时间为9sec，间隔时间为1sec，并重复60次。(3)将悬液置于4℃，静止放置10min。(4)依次重复(2)，(3)操作两次，制备获得脂质体悬液。(5)1000rpm离心脂质体悬液10min，收集上清；37000rpm超速离心上清液30min，沉积于底部的即为荧光脂质体小囊，PBS缓冲液洗涤脂质体小囊两次，并溶于20mL PBS中，得到包裹FITC的纳米型脂质体。以力度仪测量获得脂质体的直径分布，直径分布为90nm-110nm(见图1)。脂质体FITC的细胞投递于RPM1640培养基中，接种200μl SPC-A-1肺腺癌细胞(5×105cells/ml)于96孔板，37℃，二氧化碳(5％)培养箱中培养24h。PBS洗涤两次细胞，并溶于160ul无血清培养基，加入40ul脂质体FITC，37℃孵育1h，PBS洗细胞两次除去胞外未结合脂质体。脂质体FITC的细胞投递效果观察200ul胰酶消化以上贴壁细胞，2000rpm离心细胞5min，收集细胞，并溶于200ul PBS，置于激光共聚焦显微镜下观察脂质体的FITC投递效果(见图2c)。由图可见包内绿色FITC荧光，表明FITC已经被投递到细胞内部。实施例2、同实施例1步骤，其中超声波功率为400w，摸索超声波功率对脂质体制备的影响。力度仪测量结果表明800w超声波功率下制备获得脂质体大小更为均一，主要分布在90～110nm区间(见图1)。实施例3、同实施例1步骤，其中脂质体FITC的细胞孵育时间为20min，摸索孵育时间对脂质体给药效率的影响。脂质体孵育后的胞内荧光含量分析表明，此纳米脂质体在约20min后开始投递FITC到细胞内部，并在60min后大量投递FITC到细胞内部(见图2a，b，c)。实施例4、同实施例1步骤，其中脂质体配方为100mg卵磷脂，46mg CaCl2，5mg FITC和5mg罗单明B(简称Rh B，是一种发红色荧光的脂溶性分子探针，能自发结合到脂质体微球表面)。制备双重荧光脂质体，摸索脂质体透膜方式和透膜后内包药物的细胞分布情况。结果表明脂质体的透膜方式不是融合，而是内吞；且脂质体内包物质在进入细胞后能从脂质体中逃逸，并释放到细胞质中(图3)。图3A显示Rh B在细胞内的分布，图3B显示FITC在细胞内的分布，图3C显示投递药物以后的细胞外形，图4D显示Rh B和FITC在细胞内的共同分布。细胞大小约20uM，切片厚度为2uM。分布于脂质球内部的绿色荧光FITC的激发光波长和发射光波长分别为488nm和520nm，分布于脂质球表面的红色荧光Rh B的激发光波长和发射光波长分别为543nm和560nm。在双重激发光同时激发下，细胞内出现Rh B表明脂质体在投递药物同时，外层的卵磷脂也进入细胞，暗示脂质体的药物投递过程不是融合，而是内吞。细胞内Rh B和FITC并不重合，说明透膜后FITC不再局限于脂质球的内部，而是释放到细胞质中，均匀分布。细胞内Rh B分布不均匀，说明脂溶性卵磷脂在胞内相互融合；细胞内均匀分布的FITC说明水溶性FTIC逃脱脂质球后在细胞内均匀分布。实施例5(1)同实施例1步骤制备脂质体SOD并投递到肿瘤细胞内部，其中脂质体配方为100mg卵磷脂，46mg CaCl2，5mg SOD(8000U/mg)，制备内包大分子临床药物(SOD)的脂质体。(2)脂质体SOD的包埋率计算以100g/L Triton-100溶解20ml脂质体悬液离心获得的脂质体小囊，Folin-酚法测定其中蛋白含量，包埋率＝脂质体小囊SOD蛋白含量/总SOD投入量(8mg)×100％。结果表明此纳米型脂质体对SOD的包埋率为45％。以上列举的分别是试验室研究和临床给药中最具代表性的FITC和SOD的脂质体制备和应用方法，所选用的细胞为目前国内发病较多的SPC-A-1肺癌细胞。显然，本专利技术制备的脂质体包裹对象不限于以上大分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包裹大分子药物的纳米型脂质体的制备方法，其特征是依次包括以下步骤：（１）将卵磷脂、ＣａＣｌ↓［２］和大分子药物于生理盐水搅拌混匀，４℃下静置，卵磷脂、ＣａＣｌ↓［２］和大分子药物的质量比为２０∶１０∶１；（２）４℃下，对 上述混合液交替进行超声波振荡和静置，直至得到脂质体悬液；（３）１０００～２０００ｒｐｍ离心脂质体悬液，收集上清；３００００～５００００ｒｐｍ离心上清液，沉积于底部的即为脂质体小囊，ＰＢＳ缓冲液洗涤脂质体小囊并溶于ＰＢＳ缓冲液中，得到 包裹大分子药物的纳米型脂质体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：龚兴国，卢敏，赖宗腾，曾冬云，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]