生物分子的功能化方法技术

本发明专利技术涉及新的１，３－偶极环加成反应类型的偶联方法，所述方法对于生物分子例如蛋白、酶或核酸的功能化特别有用，因为它能够在水性介质和室温下进行。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术的目的在于提供新的偶联方法，所述方法对于生物分子例如蛋白、酶或核 酸的功能化特别有用，因为它可以在水性介质和室温下进行。从其高度特异性的观点来看，偶联反应是一种广泛使用在特别是化学领域中的功 能化途径。这是因为，由于是基于需要偶联的两个实体所分别携带的两个特异性基团的相互 作用，这些反应能够显著降低副反应的风险，并且一般能够保证所需偶联产物的令人满意的产率。但是，这种偶联反应的成功除了将带有两个反应性基团的化合物放在一起之外， 一般还依赖于其它参数的调整。这些参数可以是物理参数例如温度、大气压力、pH、甚至是 例如暴露于UV辐射，也可以是化学特性的，例如催化剂的存在。特别是从需要考虑上面提到的一些参数的角度来说，可以在生物条件下(体外或 体内)使用的偶联反应相当少。出于显而易见的原因，某些参数与在生物介质中的使用不相容，例如高酸性pH。此外，在生物介质中或对生物分子进行的偶联反应还强加了其它限制反应的反 应物或产物都必须是无毒的；产物和反应物对于活生物体的官能团——羧酸、胺、硫醇等来 说必须是生物学惰性的，以便获得更好的偶联特异性；反应必须在水性介质中、在生理PH 和生理温度下快速进行，并且如果可能的话必须不依赖于介质中存在的盐(Na、Cl、Mg、K 等)的浓度，而且反应在低浓度下必须是有效的。但是，作为可以使用生物特性的分子进行的偶联反应，可以提到的是基于醛/酮 基与酰胼/氨氧基(aminooxy)的相互作用的偶联反应。事实上，通过在合成(或生物合成)过程中以修饰的单体(糖、氨基酸等)形式引 入酮和醛基，它们已被广泛用于为生物分子进行修饰。然后通过将这些基团与酰胼或氨氧 基反应、装配两个抑制剂部分、用造影剂标记等，对这些基团进行可能的后续修饰[1]。不幸的是，酮和醛基的使用受到生物介质自身的限制。这是因为羰基也与胺反应， 对于包含它们的生物分子来说不是特异性的。此外，该缩合反应的最适pH是5-6 ；因此反 应非常缓慢，或介质的酸化导致一定程度的细胞死亡或敏感的生物分子的分解。已被考虑用于体内化学的另一种类型的偶联反应[2]，是基于叠氮化合物与磷化 氢(Staudinger反应)或炔烃(Huisgen 1，3_偶极环加成反应)的相互作用的反应。有利的是，叠氮基已被证明对于在活生命体世界中遇到的官能团来说是惰性的， 高能的，并且对于大量的基团来说不是非常具有反应性的。不幸的是，在第一种类型的相互作用的使用中，主要障碍是使用的磷化氢在空气 容易氧化。 对于使用叠氮基的Huisgen环加成反应来说，从它们需要使用铜盐这一事实的角 度来看，它们只可能离体使用，由于其毒性而排除了体内使用。一般公认地，通过用吸电子基团活化炔烃以免除铜的出现是可能的；但是，这些化 合物然后能够在富含亲核试剂的生物介质中发生迈克尔加成反应。用于加速叠氮化合物与炔烃的1，3-偶极环加成反应的另一种可替选方案包括在应变的多重键上进行反应，环应 变是反应的驱动力(并代替催化)。因此，利用了 Bertozzi基团来加速反应，这是由于环应 变在叠氮化合物与环辛炔之间产生了(3+2)环加成反应，该反应在生理条件下发生并且没 有明显毒性，因此能够在活生物体中的细胞上进行化学修饰[3-4]。不幸的是，叠氮化合物由于被证明对光分解敏感，并且它们中的一些具有潜在爆 炸性，因此不能被证明对于在生物介质中的使用来说非常相容。事实上，从选择性的观点来看，1，3_偶极环加成反应明显构成了特别有利的能够 在生物介质中利用的功能化途径。作为叠氮化合物/烯烃1，3偶极环加成反应的可替选方案，还存在硝酮/烯烃1， 3_偶极环加成反应。后者能够产生异噁唑烷衍生物，其可以随后被转变成大量有利产物，特 别是内酰胺、内酯、氨基醇和酮醇。该反应非常常见，提供了由内或外两种途径产生的 两对非对映异构体。硝酮与炔烃之间的同样类型的反应能够获得异噁唑啉，其随后能够经 历各种不同的重排，提供新的杂环系统。 但是，这些硝酮与不饱和烃的1，3_偶极环加成反应一般一方面在有机介质中、另 一方面在高温下进行。对于第一种限制来说，它一般是由下述事实所强行要求的，即醛与羟 胺的缩合需要无水条件以便形成相应的硝酮。但是，已经显示使用表面活性剂能够形成硝 酮并进行后者与丙烯酸乙酯的一锅环加成反应[5]。更具体来说，本专利技术是基于本专利技术人的下述观察，即已证明硝酮与特定基团的相 互作用可以在温和的、因此与体内使用相容的条件下、也就是说在水性介质和可以在室温 到体温之间变化的温度下实现。更具体来说，本专利技术是基于用于将至少一个目标分子嫁接到其它实体上的方法， 所述方法包括至少下列阶段-提供可用的所述分子，其在表面上具有至少一个根据1，3-偶极环加成反应具有 反应性的基团G1，以及-将所述分子与所提供的在表面上具有至少一个从所述1，3-偶极环加成反应的 观点来说与基团Gl互补的基团G2的所述实体，在有利于所述基团Gl与G2的所述环加成 反应的条件下放在一起，其特征在于所述基团Gl和G2分别为硝酮和应变的环炔基，或反之亦然。在本专利技术的意义上，表述“所述基团Gl和G2分别为硝酮和应变的环炔基，或反之 亦然”是指基团Gl是硝酮并且基团G2是应变的环炔基，或基团Gl是应变的环炔基并且基 团G2是硝酮。有利的是，本专利技术的方法与体外、离体和/或体内应用相容。因此，所述环加成反应可以在并优选在与生物介质相容的介质、更具体为水性介 质中进行。根据另一种优选的可替选形式，所述环加成反应可以在并优选在室温或体温下进 行。根据另一种优选的可替选形式，所述环加成反应在体内在组织的表面处或活生物 体内进行。正如在下面提出的实例中显示的，本专利技术人已经发现，硝酮与应变的环炔烃之间的1，3-偶极环加成反应能够在与生物学相容的温和条件下、即在室温下、在水性介质中进 行，并且其活化不需要使用其它添加剂。因此，本专利技术的方法特别是能够免除使用催化剂、碱或配体类型的添加剂(在常 规的点击化学中需要)，并且摆脱了铜(I)或穴状配体的毒性、或生理PH值的变化损坏细胞 存活力的问题，并且在反应在体内进行的情况下简化了生物可利用性问题。此外，本专利技术人已经发现，硝酮基团对应变的环炔烃单元的相互作用，从叠氮基团 对于同样的环炔烃单元所显示的相互作用的观点来看，被证明是特别有利的。首先，硝酮与应变的环炔烃之间的环加成反应形成了环加成物，其重排以释放出 胺，所述胺可以反过来用于将另一个分子偶联到以前通过环加成反应构建的组合体上。此外，含有叠氮基的化合物具有潜在爆炸性并因此难以操作，这与含有硝酮基的 化合物相反。因此，本专利技术的方法能够在与活生物体相容的条件下将目标生物分子嫁接到另一 个实体上，同时大体上保留生物聚合物由弱键例如氢键稳定的构象，例如蛋白的三级和四 级结构、DNA链的杂交、RNA-DNA复合物、三重螺旋或四重螺旋DNA 复合物结构等。在本专利技术的意义上，另一个实体可以是另一个目标分子或基质。本专利技术的方法一方面能够将生物分子例如核酸、蛋白、酶、抗体、寡糖、脂类等偶联 到另一种分子例如造影剂、放射性标记的分子、运输载体、配体、甚至另一种上述类型的分 子上，也能够功能化基质例如有机或无机纳米颗粒、生物材料、活组织或纳米晶体，甚至也 能够对分子进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，用于将至少一个目标分子嫁接到其它实体上，所述方法包括至少下列阶段－提供可用的所述分子，其在表面上具有至少一个根据１，３－偶极环加成反应具有反应性的基团Ｇ１，以及－将所述分子与所提供的在表面上具有至少一个从所述１，３－偶极环加成反应的观点来说与基团Ｇ１互补的基团Ｇ２的所述实体，在有利于所述基团Ｇ１与Ｇ２的环加成反应的条件下放在一起，其中所述基团Ｇ１和Ｇ２分别为硝酮和应变的环炔基，或反之亦然。

【技术特征摘要】
FR 2009-10-15 09572321.一种方法，用于将至少一个目标分子嫁接到其它实体上，所述方法包括至少下列阶段-提供可用的所述分子，其在表面上具有至少一个根据1，3-偶极环加成反应具有反应 性的基团G1，以及-将所述分子与所提供的在表面上具有至少一个从所述1，3-偶极环加成反应的观点 来说与基团Gl互补的基团G2的所述实体，在有利于所述基团Gl与G2的环加成反应的条 件下放在一起，其中所述基团Gl和G2分别为硝酮和应变的环炔基，或反之亦然。2.根据权利要求1所述的方法，其中环加成反应在水性介质中进行。3.根据权利要求1所述的方法，其中环加成反应在室温或体温下进行。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子选自标记物、着色剂、荧光团、放射 性标记的分子、造影剂(X-射线、MRI)、连接体、毒素、治疗剂、美容剂或植物保护有效成分、 特异性结合对的成员、肽、氨基酸和氨基酸残基、多肽、糖类和糖残基、光敏剂、吓啉或表现 出顺反异构现象的化合物。5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中表现出顺反异构现象的化合物选自二芳 基乙烯衍生物、螺吡喃、螺噁嗪、俘精酸酐和偶氮苯。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子是生物分子。7.根据权利要求1所述的方法，其中其它实体也是目标分子。8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中目标分子之一是造影剂。9.根据权利要求1所述的方法，其中其它实体是基质...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥德伯纳迪恩，大卫波纳非，伊莎贝尔泰可希诺盖，
申请(专利权)人：原子能与替代能源委员会，
类型：发明
国别省市：FR[法国]