本发明专利技术涉及一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法。公开了采用琼脂糖凝胶为载体，通过高碘酸盐氧化制备蛋白免疫吸附材料的方法，该方法用高碘酸盐对琼脂糖凝胶进行氧化，制备含醛基的琼脂糖凝胶，再将含醛基的琼脂糖凝胶与免疫球蛋白结合蛋白进行偶联，最后将材料进行封端，还原，或者不进行封端直接还原，即得免疫吸附血液净化材料。本发明专利技术具有工艺简单、环保、成本低等特点，同时产品的特异性、吸附性能、再生等性能优异，可实际用于临床上免疫吸附治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生 物医学材料及血液净化领域。
技术介绍
免疫吸附(immunoadsorption，IA)疗法是近十五年来发展起来的一种新的血液 净化技术，用于治疗一些传统方法难以奏效的疾病。其基本原理是先将抗原、抗体或一些具 有特异性亲和力的物质作为配体与载体相连，制备成体外吸附柱，用于体外血液净化，利用 其特异性吸附性能，选择性或特异性地清除患者血液中内源性致病因子，从而达到净化血 液、缓解病情的目的。2001年，在英国伦敦召开了欧洲第一届免疫吸附研讨会，来自17个 国家的200多位专家学者参加了会议，重点讨论了免疫吸附在风湿病、肾脏病、神经系统疾 病、血液病和心血管疾病中应用的经验。免疫吸附治疗已成为一项重要的血液净化技术。葡萄球菌蛋白A(SPA，简称蛋白A)是某些金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白 质，其分子量约为42KD。蛋白A可与人类及哺乳动物血液中的免疫球蛋白分子的Fc段结 合，特别是免疫球蛋白G(IgG)及其免疫复合物特异性结合，具有高度的亲和力。因此通过 化学方法将蛋白A连接于某一载体上制备成蛋白A免疫吸附柱，当人体血浆通过该吸附柱 时，血浆中的抗体及其免疫复合物就会被特异性吸附而去除，因此一些因抗体及其免疫复 合物导致的疾病与症状，如自身免疫性疾病、器官移植排斥反应、恶性肿瘤等即可得到治疗 或缓解。蛋白A免疫吸附柱是目前临床上应用比较成功的一种免疫吸附疗法。对于蛋白A 免疫吸附材料性能的影响因素，主要包括三个载体、活化偶联方法及蛋白A的性能。载体 方面，一般采用的载体基质主要是琼脂糖凝胶和硅胶，由于琼脂糖凝胶具有良好的生物相 容性及多孔等特性而使用最为广泛。而蛋白A方面，多为研究蛋白A的特异性及亲和性能， 同时在蛋白A耐温、耐酸碱性能也有较多研究，如Amersham Biosciences公司改变抗体结 合蛋白上的某些氨基酸，可提高蛋白在PH13-14的化学稳定性[W0 03/08655]，GE公司将蛋 白A上的不耐酸碱氨基酸换成耐酸碱的氨基酸，研究出能够耐1摩尔的碱的蛋白A，通过这 样的蛋白A制备的免疫吸附材料具有便于清洗、多次使用、安全等优点[US20100048876]。而在活化偶联方法上也有比较多的研究。目前临床上使用的蛋白A免疫吸附柱 材料，一般采用的活化方法包括溴化氰、羰基咪唑、环氧氯丙烷等方法。这些方法都具有一 定的局限性，如溴化氰活化方法中，使用的溴化氰为剧毒，合成过程中对人体和环境危害巨 大，同时溴化氰方法偶联的蛋白容易脱落等缺点。而使用环氧氯丙烷活化方法，一般还要使 用二胺、二醛过渡增加间隔臂，然后再偶联蛋白A，制备过程繁琐且二胺、二醛反应都会有交 联副反应发生，同时由于胺与醛反应生成西弗碱(Schiff Base)，即有碳-氮双键的生成， 使得材料具有颜色，因此还原过程中使用大量的还原剂，可能对蛋白A的性能具有影响。而 且在还原过程中一般很难将其还原成白色，为还原的碳氮双键具有比较明显的非特异性吸 附。同时，这种蛋白A材料在放置及使用一段时间，有颜色再变深的趋势，影响蛋白A吸附柱的性能。同时，除了蛋白A，在免疫球蛋白结合蛋白中，还有蛋白G和蛋白L。这类蛋白是一 类来源于细菌、能选择性吸附哺乳动物(包括人)的免疫球蛋白的蛋白分子。这类分子往往 包含一定程度的重复序列(即同源片段)，且结构简单、稳定性高，能与免疫球蛋白进行可逆 结合等。这类蛋白的最大特点在于其对免疫球蛋白或抗体的选择性吸附作用，目前，蛋白 A、蛋白G和蛋白L都已被开发成抗体吸附介质的功能分子，广泛应用于抗体纯化、制备和生 产。特别是蛋白A，不仅已经开发出一系列的抗体吸附产品，更通过基因工程的方法，开发出 耐强碱的重组蛋白A，为单克隆抗体药物的生产提高了强有力的纯化工具。但这三种蛋白的 应用仍受到其本身的反应性范围所限，如对于Fab段和基因工程单链抗体scFv的纯化，蛋 白A和蛋白G都显得无能为力。而嵌合体蛋白的优势将得到体现，较为典型的是BioVision 公司开发的Protein AGL，这个重组体可吸附不同种属来源的几乎所有类型的免疫球蛋白， 是纯化生产多克隆抗体、单克隆抗体以及基因工程抗体的理想工具。除抗体纯化外，免疫球蛋白结合蛋白(Immunoglobulin-binding proteins, IBP) 分子还被用于免疫吸附一一种通过去除体内抗体达到治疗目的的临床疗法[Matic，et al. TherApher. 2001; Samuelsson. JClinApher. 2001]。其中，蛋白 A 免疫吸附已被 证明对多种疾病具有临床疗效，包括FDA批准的适应症原发性血小板减少性紫癜(ITP)、 难治性类风湿性关节炎(refractory RA)和血友病，以及标注外的适应症(即off-label， 又称为非适应症使用，意为在非FDA批准的适应症中使用某疗法或药物，这种现象在许多 药物和疾病治疗中都普遍存在。)血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和溶血性尿毒症综合征 (HUS)。另外，还有很多种疾病，尽管仍缺乏足够的临床试验证据，但相当数量的研究文献 显示，蛋白A免疫吸附对这些疾病的疗效令人期待，这包括慢性炎症性脱髓鞘性多发性神 经根性神经病(CIDP)、重症肌无力(MG)、伴癌综合征、扩张性心肌病(DC)、系统性红斑狼疮 (SLE)、急性进展性肾小球肾炎(RPGN)以及肾移植(降低抗体介导的超急性排斥反应的发生 几率、抑制移植后的排斥反应等，以提高移植物的存活几率、延长移植物的存活时间)另一 方面，蛋白A免疫吸附的临床安全性也已经得到确认，这种疗法被认为具有较好的临床耐 受性[Snyder，et al.]。目前，经FDA批准上市的蛋白A免疫吸附产品有两种SPA-siliCa Prosorba(Fresenius Medical Care 公司生产)禾口 SPA-Sepharose Immunosorba(Cobe BCT 公司生产，2000 年被 Fresenius Medical Care 公司收购)。1987 年和 1999 年，Prosorba 分别被FDA批准用于原发性血小板减少性紫癜和难治性类风湿性关节炎的治疗；1998年， Immunosorba被FDA批准用于血友病的治疗。但除蛋白A外，目前仍未见以其他IBP分子或嵌合体作为功能分子的吸附介质用 于临床免疫吸附治疗的报道。尽管如此，与蛋白A相比，蛋白G和蛋白L的抗体吸附性能仍 具有一定的互补性，尤其是嵌合体蛋白，更表现出更高、更全面的抗体吸附性能，因此，随着 免疫吸附技术的深入研究和临床应用的广泛开展，以蛋白G、蛋白L或嵌合体作为功能分子 的吸附介质必将受到关注，相关产品的开发和临床应用也将受到重视而加速发展。另外，在非常具有应用前景的以嵌合体蛋白(尤其是Protein LG, Protein LA和 Protein AGL)为功能分子的吸附介质中，由于功能分子对免疫球蛋白的亲和力提高，导致 抗体洗脱条件更为苛刻，如在pH2. O的条件下才能将90-95%结合于Protein LG的免疫球蛋 白洗脱[Kihlberg，et al.]，这会是洗脱下来的抗体更不稳定而不利于抗体活性的保留；同时，由于IBP分子本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，其特征在于它包括如下步骤：１）用高碘酸盐溶液直接对琼脂糖凝胶进行氧化，制备含醛基的琼脂糖凝胶；２）将步骤１所得含醛基的琼脂糖凝胶与免疫球蛋白结合蛋白进行偶联；３）将步骤２所得材料进行封端，然后用还原剂还原。
【技术特征摘要】
1.一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方法，其特征在于它包括如 下步骤1)用高碘酸盐溶液直接对琼脂糖凝胶进行氧化，制备含醛基的琼脂糖凝胶；2)将步骤1所得含醛基的琼脂糖凝胶与免疫球蛋白结合蛋白进行偶联；3)将步骤2所得材料进行封端，然后用还原剂还原。2.根据权利要求1所述的一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方 法，其特征在于步骤1所述高碘酸盐为高碘酸钠、高碘酸钾或两者的混合溶液。3.根据权利要求2所述的一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方 法，其特征在于所述的高碘酸盐溶液浓度为0. 05-0. 4摩尔/升，琼脂糖凝胶与高碘酸盐溶 液的质量比为1:0. 5-1:5，氧化温度为4-50°C，氧化时间1-10小时。4.根据权利要求1所述的一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方 法，其特征在于步骤2所述的免疫球蛋白结合蛋白包括蛋白A、蛋白G、蛋白L或三者的任意 比混和。5.根据权利要求1所述的一种高碘酸盐氧化制备用于清除致病抗体吸附剂的合成方 法，其特征在于步骤2所述的含醛基的琼脂糖与免疫球蛋白结合蛋白进行偶联时，免疫球 蛋白结合蛋白溶液的浓度为0. 5-30mg/ml，免疫球蛋白结合蛋白水溶液的pH值为4_11，含 醛基的琼脂糖与免疫球蛋白结合蛋白溶液的质量比为1 0. 5-1 50，偶联温度为4-90°C，偶 联时间为0....
【专利技术属性】
技术研发人员：陈校园，张旭锋，许春生，艾福金，余波光，
申请(专利权)人：广州康盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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