本发明专利技术公开了用于采用成像仪器进行化合物筛选的基于细胞的多元测定的方法。本文所述方法提供关于检测试剂的生物效价、脱靶效应和潜在候选药物的细胞毒性等的高容量的信息。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及高容量的细胞筛选测定(high-content cellular screeningassay)，更具体地涉及用于筛选细胞刺激剂并在单细胞或单细胞群中采用报告分子的多元监测的测定。
技术介绍
发现一种新的治疗剂的过程传统上包括以下阶段，在患者或者合适的模型系统 中i)鉴定药物靶标；ii)验证该靶标；iii)筛选影响靶标活性的化合物；iv)测定先导 化合物的毒性；V)测定先导化合物的副作用；和Vi)考查先导化合物的代谢及稳定性。 一旦鉴定并验证潜在的治疗靶标，药物发现的初始阶段需要筛选通常是成数十万种化合 物，来鉴定那些以适当治疗方式调节靶标的药物。这种筛选过程需要开发能够迅速廉价 地测量调节目的靶标因子的化合物的效力的测定技术。这些高通量的筛选测定可采取各 种形式，其包括通常依靠基于比色、荧光、放射性测量或发光的检测的基于细胞的测定 或生化测定，以测量受体激活、RNA浓度、蛋白浓度、酶活性或蛋白质间形成功能复合 体的物理相互作用。药物发现领域面临的始终的挑战是提高速度和效率，依赖这种速度 和效率从化合物筛选库中所测定的数十万种化学化合物里鉴定出潜在的先导化合物，然 后优化成新的药物。在先导化合物优化过程中遇到的一个普遍问题是，最初根据其调节 一种或几种特定靶蛋白活性的能力鉴定出的候选药物，也常常有一种或多种禁忌症。化 合物缺乏特异性从而导致药物除了既定的靶标外还靶向范围广泛的因子和生物过程，这 能够产生有害作用。令人关注的其它领域包括药物毒性和代谢，这些引起毒性反应的化 合物能破坏正常细胞和组织的功能，导致细胞死亡。某些化合物也已被证实调控其自身 代谢，藉此刺激该靶物质分解并从机体排泄，导致药效降低。目前高通量的筛选测定通常集中于测量化合物在调控单一因子或靶标的活性中 的效用，并依赖于二次筛选及后续分析(follow-upanalyse)的延续过程，以便测定化合物 功能的其它特性，例如特异性和毒性。这增加了将化合物开发并优化为具有高治疗指数 (即高效率、高特异性、低毒性)的药物所需的时间及花费。结果，很多因为其对靶标的 活性而原本被选定的化合物，最终因为后续发现的副作用被放弃，导致在先导药物评价 上所做的努力浪费，这最终证明不能令人满意。在药物发现和先导药物优化过程中，需要更快速、更高效、更廉价、特别是信 息丰富的筛选测定，这样的测定同时提供关于各种化合物特性及其对各种细胞途径作用 的信息(即功效、特异性、毒性和药物代谢)。例如，先前采用过的一种方法阐述于US 2005/0164321 (PromegaCorp)中，其阐述了用酶介导反应的方法，该方法用于在同一孔中的多元发光和不发光测定，以检测样 品中一个或多个部分的量(例如活性)或存在情况，所述部分包括酶促反应的辅因子(例 如ATP)、结合和/或改变分子构象的蛋白质(肽或多肽)(例如修饰或剪切肽或多肽底物 的蛋白质)或被蛋白质结合和/或改变的分子。WO 98/58074(Allelix Biopharma)阐述了用于筛选化学化合物以鉴定受体(包括G-蛋白质偶联受体)的配体的测定方法和组合物。该专利技术采用的细胞为其中目标受体通过第二信使系统被偶联到受环核苷酸门控(gate)的离子通道的细胞。受体刺激导致第二 信使系统产生环核苷酸，这导致可测量的离子通过通道流入。该专利技术还提供了这样的多 元系统，其中用不同的离子内流(ion influx)荧光报告分子装载表达不同受体类型的混合 细胞培养物。EP1439384(Cellomics Inc)提供用于测定细胞中荧光标记报告分子的分布、环境 或活性的方法和分析系统，所述方法和分析系统的目的是筛选大量的特异性影响特定生 物功能的化合物。Bertelsen, M.，(Methods in Enzymology，(2006), 414 348-363)阐述了使用 高容量的成像系统进行炎症信号转导和细胞内蛋白质易位的多元分析。Howell, B.J.等(Methods in Enzymology，(2006)，284-300，2006)阐述了基于细胞的多元成像测定的开发和实施，所述测定采用荧光显微镜监测细胞增殖、细 胞周期阶段和细胞凋亡。Nickischer, D.等(Methods in Enzymology，(2006), 414, 389-418)阐述了三 种促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)细胞内信号转导途径成像测定的开发和实施，以便 为激酶抑制剂提供MAPK模块选择性概况分析(profiling) MK2-EGFP易位、c_JUN和 ERK活化。Hanson, B.等(J.Biomolecular Screening，(2006)，U, 644-651)阐述了多元细 胞内测定，其通过联合fluo-4钙迁移测定和β内酰胺酶报告系统，使得可以用单细胞系 进行两个G-蛋白偶联受体测定药物筛选。Jonas, J-C.等(Diabetes，(1998)，47, 1266-1273)阐述了细胞内 Ca2+浓度和细 胞外胰岛素从用葡萄糖刺激的分离的胰岛细胞的细胞灌流液中分泌之间的时间和数量关 系，所述胰岛素。在含有葡萄糖的培养基中用钙指示剂fUra-PE3装载培养的胰岛，并将 单个胰岛转移到灌注室中。用荧光显微镜测量，而用RIA测定灌流液下游收集的 组分中的胰岛素。因此，本文阐述了 与大群混合(即异质)的细胞群的胰岛素分 泌之间的关系，因此在单细胞水平上，细胞刺激与相关的分析物的产生之间没有特定的 相关性。此外，Jonas等没有阐述细胞相关的分子/分析物的多元测定或测量。Marriott 等(J.Cellular Physiology，1998，177，2，232-240)阐述了鼠腹腔巨隨 细胞内白细胞介素6mRNA表达的诱导和细胞内钙的测量。mRNA和细胞内钙的测量都 是细胞内事件，因为mRNA不被细胞分泌。Veronesi 等(Neurotoxicology，2003，24，463-473)阐述了支气管-气管上皮细 胞的胞内钙和胞外IL-6测量。在该论文中，IL-6与细胞无关，用ELISA进行下游测量。McMillen等(Clinical Care Medicine，1995, 23, (1) 34-40)阐述了用下游放射免 疫分析法进行人单核细胞的胞内钙的测量和胞外IL-6的测量，这种方法的实施不需细胞 洗涤步骤。Dracker 等(Blood，2002，100，(11)，摘要编号 5025)报道了用下游 ELISA 进行多发性骨髓瘤细胞系的胞内钙和胞外IL-6的测量，其不需细胞洗涤步骤。Kohno等(Diabetes，2003，坠，(4)948-956)披露了在同一细胞群中细胞内钙的 测量和神经肽Y(NPY)的免疫化学染色。在用4%低聚甲醛对死细胞进行细胞固定后检 测 NPY。Lundgren 等(World Journal of Surgery，1996，20, (7)727-735)阐沭了通过下游 放射免疫分析法测量人甲状旁腺细胞的胞内钙和胞外PTH，其不需细胞洗涤步骤。以上方法都没有给出来自刺激活细胞的即时及多元的高容量信息，其中在来自 单一同质细胞群的细胞中测量胞内及与细胞相关本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于在单个活细胞群中测量至少一种细胞内事件及细胞相关分析物的方法，其中所述至少一种细胞内事件和所述细胞相关分析物是在所述细胞中运行的协同生物化学过程的各个组分，所述方法包括以下步骤： ａ）提供含有单个活细胞群的样品； ｂ）让所述单个细胞群中的至少一个活细胞与引起或怀疑引起所述至少一个细胞产生细胞相关分析物的检测试剂接触； ｃ）在所述至少一个细胞中测量物理性质的变化，作为至少一种细胞内事件的度量； ｄ）洗涤所述细胞以去除细胞外液体； ｅ）测量所述细胞相关分析物的存在、含量或活性；和 ｆ）将所述至少一个细胞中的所述至少一种细胞内事件的变化与所述细胞相关分析物的存在、含量或活性相联系。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：JK霍尔顿，
申请(专利权)人：通用电气医疗集团英国有限公司，
类型：发明
国别省市：GB
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