转运蛋白是一个新兴的靶标家族，具有巨大的潜力，可提供科学和经济机会。钠／钙交换体是从不同细胞中去除Ｃａ２＋的重要机制。在心脏中，它排除通过Ｃａ２＋通道进入的Ｃａ２＋引起收缩，同时Ｎａ＋进入心脏细胞。鉴定出调节钠／钙交换体活性的化合物是相当有价值的。本发明专利技术涉及用于检测ＮＣＸ和ＮＣＫＸ“正向模式”调节化合物的基于荧光的测定法。本发明专利技术还涉及包含表达（ｅｘｐｒｉｍｉｎｇ）钠／钙交换体的细胞的组件试剂盒，以及组件试剂盒在检验化合物作为钠／钙交换体的激动剂或拮抗剂的活性中的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及钠/钙交换体(sodium/calcium exchanger)和检测其活性的方法。 更准确地讲，本专利技术涉及用于检测钠/钙交换体“正向模式”调节化合物的基于荧光的测定 法。本专利技术还涉及包含表达钠/钙交换体的细胞的组件试剂盒(kit of parts)及组件试 剂盒的用途。
技术介绍
生命的一个基本的必要条件是区室化——以生物膜作为实现这一原则的天然工 具。然而，脂双层——构成细胞膜基础的结构——对大多数离子和化合物是不渗透的，而这 些离子和化合物的转运是维持细胞和生物体的生命机能所必需的。这种反论的答案在于细 胞膜的半渗透性质——必须跨过膜的溶质通过特定的膜蛋白转运。这些转运蛋白负责离子 梯度的产生和维持，营养物的摄取，代谢产物的转运，信号转导分子的重摄取以及毒性和废 弃化合物的清除。因此，在这种情况下，转运蛋白是允许直接影响疾病相关性异常状况的潜 在的药物靶标。人钠/钙交换体基因家族(亦称为NCX或SLC8)包括三种截然不同的蛋白，NCXl、 NCX2 和 NCX3。SLC8 与 SLC24 —起构成 Na+/Ca2+ 反向转运蛋白(countertransporter)的超 家族。SLC24家族成员还转运K+，亦称为NCKX。NCXl是该家族中表征最充分的成员，在人衰竭性心脏中它的表达被上调，并在心 肌梗死后参与缺血-再灌注损伤(ischemia-r印erfusion damage)。抑制NCXl使衰竭性心 脏的心肌收缩性正常化，并且在缺血再灌注后发挥心脏保护作用(Flesch等，Circulation 1996 ；Komuro 禾口 Ohtsuka，Journal of Pharmacological. Sciences. 2004)。 NCX2 主要在大 脑中表达，NCX3主要在大脑和骨骼肌中表达，其生理作用不详。钠/钙交换体是从不同细胞中去除Ca2+的重要机制。在心脏中，它排除通过Ca2+ 通道进入的Ca2+引起收缩，同时使Na+进入心脏细胞。其在心血管疾病中的关联性参见 例如 Hobai，JA 禾口 0’ Rourke，B (2004) Expert Opin. Investig. Drugs，13，653—664。因此， 制药业已开发出抑制NCX的化合物，参见例如Iwamoto，Τ.等(2004) J. Biol. Chem.，279， 7544-7553。对于以相反方向移动的每个Ca2+，Na+/Ca2+交换体以产生电的方式转运3_4个 Na+，例如Hinata，M.等(2002) J. Physiol. 545，453-461中的电生理学方法所示。NCX能够 维持低于胞外Ca2+浓度(入)3-4个数量级的胞质Ca2+浓度(出)。然而，净 Ca2+转运的方向取决于Na+的电化学梯度。有研究提出Na+和Ca2+转运的同时转运模型和 相继转运模型，大量证据支持后者。转运蛋白是一个新兴的靶标家族，具有巨大的潜力，可提供科学和经济机会。另一 方面，就药物开发技术而言转运蛋白是困难的靶标类别。鉴定例如通过阻断钙的流动和/或抑制钙通道的活化来调节通道活性的化合物 是相当有价值的。这样做的一种标准方法是通过采用膜片钳实验。在这些实验中，必须由技术娴熟的操作人员，通过测量在响应膜电位变化和/或试验化合物应用时跨越细胞膜的钙流，依次个别地对细胞进行评价。研究了 Sea0400(NCX 的一种新的特异性抑制剂)对狗心室乳头肌的动作电位的作用，参见K. Acsai在“2004年 ESC 大会，，期间发表于 Munich on Poster Nr. 2886 的文献(标题Effect of a specific sodium-calcium exchanger blocker Sea0400on the ventricular action potential and triggered activity in dog ventricular muscle and Purkinje fiber (特异j"生 内 _ f丐 交换体阻断剂Sea0400对心室动作电位的作用和引发的狗心室肌和浦肯野纤维的活性)) 以及 C· Lee 等(The journal of pharmacology and experimental therapeutics ；第 311 卷748-757，2004 ；标题！Inhibitory profile of SEA0400 phenoxy]-5-ethoxyaniline]assessed on the cardiac Na+/Ca2+exchanger， NCXl·l(评价SEA0400苯氧基]_5_乙氧基苯胺]对心脏 NaVCa2+交换体NCX1. 1的抑制特征))。采用离子选择电极技术定量测定巨膜片(giant patch)中离子流的研究表明，心 脏 Na+/Ca2+交换体具有多种转运模式(Tong Mook Kang 和 Donald W. Hilgemann ；Nature ； % 427 2004 ^ 2 B 5 H ；丰示H :Multiple transport modes of the cardiac Na+/Ca2+ exchanger (心脏Na+/Ca2+交换体的多种转运模式))。这些实验虽然有效并提供大量信息，但却非常耗时而且不适于对调节钙离子通道 活性的化合物进行高通量测定。多种技术已发展成为电生理学标准方法的备选方法。例如，已采用放射性流量 测定法(radioactive flux assay)，其中将细胞暴露于放射性示踪物(例如45Ca)中并 监测放射性标记的Ca流量。将负载有示踪物的细胞暴露于化合物中，增加或减少示踪物 流出的那些化合物被鉴定为潜在的细胞膜离子通道的激活剂或抑制剂。一个具体实例 0β Τ. Kuramochi φ ；Bioorganic & Medicinal Chemistry ； 12 (2004) 5039-5056 ； feH Synthesis and structure-activity relationships of phenoxypyridine derivates as novel inhibitors of the sodium-calcium exchanger (作为 内 _ f丐交换体新型才IpfU齐[J的 苯氧基吡啶衍生物的合成和结构_活性关系)。EP1031556公开了其中使用肌膜囊泡测定 NaVCa2+交换体活性的方法，通过测量45Ca的放射性来测定肌膜囊泡中Ca2+摄取的浓度。多种放射性离子转运蛋白测定法的灵敏度有限，因此数据质量不佳。另外，与放射 性筛选技术有关的成本和安全问题是妨碍广泛应用的障碍。在上述药物开发技术中，应用放射性流量测定法来鉴定调节离子通道和离子转运 蛋白活性的化合物是与本专利技术最接近的现有技术，因为该技术可以通过监测细胞的Ca2+流 量来将试验化合物鉴定为潜在激活剂或抑制剂。放射性测定法的主要问题出在检测每秒约1-1000个分子的离子转运蛋白的周转 受限(小于大多数离子通道的约104倍)的困难上。因此，由现有技术水平所产生的问题是确定在高本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：M胡格，T利歇尔，S盖贝尔，H福勒特，
申请(专利权)人：赛诺菲安万特，
类型：发明
国别省市：FR
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