胞外基质组合物制造技术

本发明专利技术涉及产生包括胚胎蛋白质的组合物的方法。该方法包括在低氧条件下在生物相容的二维或三维表面上体外培养细胞。该培养方法产生可溶部分和不可溶部分，它们可以分开使用或组合使用，以获得生理上可接受的用于各种医疗和治疗应用的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】胞外基质组合物专利技术背景专利
本专利技术一般涉及胞外基质组合物的产生和应用，更具体涉及通过在低氧条件下于合适的生长培养基中在表面上培养细胞得到的蛋白质。背景信息胞外基质(ECM)是围绕和支持细胞的复杂结构实体，其被体内发现于哺乳动物组织中。ECM通常称作结缔组织。ECM主要由三种主要类型的生物分子组成，包括如胶原蛋白和弹性蛋白的结构蛋白，如肌原纤蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白的特化蛋白质，和蛋白聚糖。本领域已述及ECM组合物的体外生长及其在各种治疗和医学应用中的使用。此类ECM组合物的一种治疗应用包括软组织和皮肤缺陷的治疗和修复，如皱纹和疤痕。由如痤疮、手术疤痕或衰老的缺陷引起的软组织缺陷的修复和加强已被证实非常困难。许多材料已经用于校正软组织缺陷，取得了不同程度的成功，但是，没有材料完全安全和有效。例如，硅引起各种生理和临床问题，包括长期副作用，如小结、复发性蜂窝组织炎和皮肤溃疡。胶原蛋白组合物也已经用作软组织加强的可注射材料。胶原蛋白是结缔组织的主要蛋白质和哺乳动物中最丰富的蛋白质，构成总蛋白质含量的约25％。文献中目前述及28种胶原蛋白(详细的清单，参见，如以下表1和表2)。但是，体内超过90％的胶原蛋白是胶原蛋白I、II、III和IV。不同的胶原蛋白材料已经用于软组织缺陷的治疗，如重构可注射牛胶原蛋白、交联的胶原蛋白或其它异源胶原蛋白。但是，这些胶原蛋白存在几个问题。常见的问题包括为去除潜在免疫原性物质以避免对象体内过敏反应制备植入材料的复杂性和高成本。此外，利用这些胶原蛋白治疗的长期持久性还未被证实。也已述及其它可用于软组织修复或加强的材料，如，含水凝胶中的生物相容性陶瓷颗粒(美国专利号5,204,382)、热塑性和/或热硬化性材料(美国专利号5,278,202)和乳酸基共混聚合物(美国专利号4,235,312)。此外，也已述及天然分泌的ECM组合物(美国专利号6,284,284)。但是，这些材料经证实均有局限性。因此，需要新材料用于软组织修复和加强，克服前述材料的缺陷。这种需要在于提供安全、可注射、长期持久性、可生物吸收的软组织修复和加强材料。体外培养的ECM组合物可另外用于治疗受损组织，如，受损心肌及相关组织。该组合物可用作植入物或植入装置上的生物涂层，装置如支架；促进如心脏及相关组织的器官内血管化的人造血管；和在疝气修复、盆底修复、创面修复和肩袖修复中有用的装置，如膜片(或补片，patch)和类似物。冠心病(CHD)，也被称作冠心病(CAD)、缺血性心脏病和动脉粥样硬化心脏病，其特点是供给血液和氧气到心脏的小血管窄化。冠心病通常由称作动脉硬化的病症引起，其发生于脂肪物质和斑块积聚在动脉壁上引起动脉窄化时。由于冠状动脉窄化，流向心脏的血液可减慢或停滞，引起胸痛(稳定性心绞痛)、气短、心脏病发作及其它症状。在美国冠心病(CHD)是引起男性和女性死亡的主要原因。根据美国心脏协会(AmericanHeartAssociation)，1500万人以上有某些形式的该病症。尽管冠心病的症状和体征在疾病晚期明显，大多数冠心病患者在心脏病突然发作之前数十年没有随疾病进展而表现出疾病。该疾病是引起突然死亡最普遍的原因，也是年龄20岁以上男性和女性死亡最普遍的原因。根据美国的目前趋势，一半健康的40岁男性会在将来患有CHD，三分之一健康的40岁女性同样如此。在患病心脏或其它受损心脏中改善血流的当前方法包括创伤性外科手术技术，如，冠状动脉旁路手术、血管成形术和动脉内膜切除术。这些方法自然在手术中和手术后具有高度的固有风险，并且通常仅为心肌缺血提供临时治疗。因此，需要新的治疗选择以增加当前可用技术治疗CHD和相关症状的成功。体外培养的ECM组合物可另外用于修复和/或再生受损细胞或组织，如软骨或骨软骨细胞。骨软骨组织是有关或包含骨或软骨的任何组织。本专利技术所述的组合物对以下骨软骨缺陷的治疗有用，如退化性结缔组织病，如类风湿和/或骨关节炎，及由于外伤具有软骨缺陷的患者的缺陷。当前修复骨软骨损伤的尝试包括植入在生物相容和生物可降解水凝胶移植物中的人软骨细胞，试图提高恢复关节软骨损伤的可能性。此外，已述及在藻酸盐珠子或包括聚硫酸化藻酸盐的基质中的软骨细胞培养技术，生成透明型软骨组织。但是，通过人自体软骨细胞的植入来修复关节软骨的软骨内损伤的尝试取得了有限的成功。因此，需要新的治疗选择以增加当前可用技术治疗骨软骨缺陷的成功。体外培养的ECM组合物也在组织培养体系中有用，用于生成工程化组织植入物。组织工程化领域包括利用细胞培养技术来生成新的生物组织或修复受损组织。在干细胞革命的部分推动下，组织工程技术为损伤后组织再生和替换或退化性疾病的治疗提供了希望。其也可用于美容过程领域中。组织工程技术利用各种细胞类型和培养技术可用于生成自体或异源组织或细胞。在构建自体植入物中，可以获得供体组织并将其解离成单个细胞，随后附着于待植入在功能组织期望位点的基底上并在其上培养。利用细胞培养技术，许多分离的细胞类型可在体外扩增，但是依赖贴壁细胞需要特殊环境，通常包括三维支架的存在，其起生长模板的作用。当前组织工程技术一般提供人造植入物。成功的细胞移植疗法依赖于用于体内和体外组织培养的合适的基底的发展。因此只包含天然材料并适于植入的ECM的发展会有更多内源组织特性。因此，天然ECM材料的生成是组织工程领域中持续的挑战。专利技术概述本专利技术部分基于如下基本发现，在刺激早期胚胎环境(如，低氧和减少的重力)的条件下培养于表面(如，二维或三维表面)的细胞产生具有胎儿特性的ECM组合物。通过在低氧条件下于包含一种或多种胚胎蛋白质的表面上培养细胞产生的ECM组合物具有多种有益的应用。在一种实施方式中，本专利技术提供制备包含一种或多种胚胎蛋白质的ECM组合物的方法。该方法包括在低氧条件下于合适的生长培养基中在表面(如，二维或三维表面)上培养细胞，产生可溶和不可溶的部分。在不同方面，该组合物单独包括可溶或不可溶的部分，及可溶和不可溶部分的组合。在不同方面，产生的组合物包括层粘连蛋白、胶原蛋白和Wnt因子的基因表达的增量调节和产生。在其它方面，产生的组合物包括层粘连蛋白、胶原蛋白和Wnt因子的基因表达的减量调节。在其它方面，该组合物是物种特异性的并包括来自单个动物物种的细胞和/或生物材料。尽管体外培养的ECM组合物在人类治疗中有用，该组合物也可用于动物的其它物种。因此，该组合物非常适合兽医应用。在另一实施方式中，本专利技术提供产生Wnt蛋白质和血管内皮生长因子(VEGF)的方法。该方法包括在低氧条件下于合适的生长培养基中在表面(如，二维或三维表面)上培养细胞，从而产生Wnt蛋白质和VEGF。在不同方面，生长培养基无血清且低氧条件为1-5％氧。在相关方面，与约15-20％氧的氧条件下产生的培养基相比，Wnt种类被增量调节。在示例性方面，Wnt种类是wnt7a和wnt11。在另一实施方式中，本专利技术包括通过用本文所述的ECM组合物接触要被修复或再生的细胞进行细胞修复和/或再生的方法。在一方面，该细胞是骨软骨细胞。因此，该方法考虑骨软骨缺陷的修复。在另一实施方式中，ECM组合物可用作植入物或植入装置上的生物涂层。在不同方面，本专利技术的组合物包括在植入物中或用作可植入装置——如支架和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备包含一种或多种胚胎蛋白质的组合物的方法，包括：　　在低氧条件下于适当的生长培养基中在表面上培养细胞，从而生成包含一种或多种胚胎蛋白质的可溶和不可溶组合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2008-1-30 61/024,854;US 2008-3-6 61/034,361;US 1.一种制备包含一种或多种胚胎蛋白质的ECM组合物的方法，包括：在低氧条件下于适当的生长培养基中在珠子表面上培养细胞2-4周，从而生成包含一种或多种胚胎蛋白质的可溶和不可溶组合物，其中所述低氧条件是1-5％氧，其中所述细胞是新生成纤维细胞。2.权利要求1所述的方法，其中所述生长培养基包括血清。3.权利要求1所述的方法，其中所述生长培养基无血清。4.权利要求1所述的方法，其中透析、冻干并在缓冲剂中重构所述可溶组合物。5.权利要求1所述的方法，其中透析、干燥并在缓冲剂中重构所述可溶组合物。6.权利要求1所述的方法，其中所述细胞是种特异性的。7.一种权利要求1所述方法制备的ECM组合物，其中所述组合物是可溶部分。8.一种权利要求1所述方法制备的ECM组合物，其中所述组合物是不可溶部分。9.一种权利要求1所述方法制备的ECM组合物，其中所述组合物是可溶和不可溶部分的组合。10.权利要求7、8或9的ECM组合物在制备用于修复和/或再生需要其的对象细胞的药物中的应用。11.权利要求10所述的应用，其中所述细胞是骨软骨细胞。12.一种组织再生膜片，包括权利要求7、8或9中任一项所述的ECM组合物。13.一种组织培养方法，其使用权利要求7、8或9中任一项所述的ECM组合物。14.权利要求13所述的组织培养方法，其中所述方法用于支持干细胞的生长。15.权利要求14所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：GK诺尔顿，F捷格罗，M加特纳，K尼基，
申请(专利权)人：希斯托金公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]