流感疫苗的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种含有ＨＡＮＡ抗原－ＭＤＰ衍生物复合体的新流感疫苗．其制备过程是：将流感ＨＡＮＡ抗原与至少一种ＭＤＰ衍生物在适当的介质中混合，用可透析去除的一种表面活化剂处理，使混合物溶解，这种溶解过程是在有或没有胆固醇，卵磷脂和磷酸双鲸酯或它们的混合物条件下进行，然后通过透析去除其中的表面活性剂．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新的流感疫苗，特别涉及一种自流感病毒获得的HANA抗原与胞壁酰二肽衍生物(以下称为MDP衍生物)人工合成囊泡样复合体颗粒组成的流感疫苗，HANA抗原为这种疫苗的活性成分，MDP衍生物为合成佐剂，这种人工合成颗粒在大小和形状上与天然发生的流感病毒颗粒相似。本专利技术还涉及制备这种新疫苗的方法。由于目前使用的流感HA疫苗的接种效果受发生在流行病毒HA(血凝素)分子上的突变变异影响，因此开发较传统所用更为有效的疫苗成为紧迫的要求。在流感疫苗开发方面的最新进展之一就是由HA和NA(神精氨酸酶)为主要成份的一种合成疫苗的出现，即流感HANA疫苗。形成的这种含有纯化HANA的疫苗在安全性和效果上被认为是一种理想的疫苗，并且在美国已被用于实践。然而，这种疫苗的效果实际上仍有不足之处。从另一方面看，再有的进展就是佐剂的使用。这项工作已导致对胞壁酰二肽(MDP)及多种MDP衍生物的开发，适当的化学修饰使MDP衍生物作为新型佐剂材料在免疫潜能等方面得到改善。例如，Kotani等人在YAKUGAKU ZASSHI这本期刊的1983年第103卷一期第1～27页上发表了有关这些MDP衍生物的报告。它们提到将6-0-(2-四癸基六癸酰基)MDP与含有高度纯化作为主要成分的HA和NA流感疫苗(即HANA)一起注射给豚鼠，并报告说已得到了有效的佐剂效应。然而，将MDP衍生物作为佐剂简单地加入疫苗所得到的HANA疫苗并不具有足够的作用。因此，本专利技术的主要目的是提供一种较传统所用具有更良好的致免疫性的新型流感疫苗。本专利技术的另一目的是提供一种包括人工合成囊泡样HANA抗原-MDP衍生物复合体颗粒的新型流感疫苗，此复合颗粒与天然病毒颗粒在颗粒大小和形状上几乎相同。本专利技术的这些及其它的目的通过下面的描述会更清楚。按照本专利技术，提供一种包括人工合成的HANA抗原复合物的囊泡样颗粒和至少一种MDP衍生物的流感疫苗，MDP衍生物组成此颗粒的膜(相当于天然流感病毒颗粒的脂膜)，HANA抗原与MDP衍生物相连出现在此膜上以形成复合体，这样，此种复合体就与简单地将一种疫苗和一种佐剂混合得到的疫苗不同了。因此，按本专利技术所获得的人工合成HANA抗原-MDP衍生物复合体囊泡样颗粒就具有了与天然病毒颗粒几乎相同的颗粒大小和几乎相同的形状。图1和图2分别为本专利技术的1号试样疫苗和2号试样疫苗的电镜显微照片(放大150，000倍);图3为本专利技术4号试样疫苗的电镜显微照片(放大200，000倍);图4代表用蔗糖梯度离心法所得到的密度区带的比较，以确定本专利技术的此种复合物的构成。这种新的流感疫苗可用下述专门的方法制备。首先在某种适当的缓冲液中，例如磷酸盐缓冲液，将流感HANA抗原与MDP衍生物以重量比10/1～1/300的比值混合后，再加入有效量的表面活化剂(0.1～10重量/体积%)，使形成的混合物溶解。此后，用透析方法将这种表面活化剂除去，便得到一种新的HANA抗原-MDP衍生物复合体。在此，最重要的是要使用一种可经透析去除的表面活化剂。这类表面活化剂举例包括辛基苷、胆酸钠等。参考图1～3，得到的HANA抗原-MDP衍生物复合体形成所谓病毒体，在病毒体内MDP衍生物本身使人工合成囊泡得以形成，而HANA抗原则通过它们狭窄的未端与颗粒表面结合，使得它们与存在天然病毒颗粒表面上的此抗原具有相同的方位。根据本专利技术的另一方面，MDP衍生物可与(Ⅰ)胆固醇(Ⅱ)卵磷脂和磷酸双鲸酯(dicetyl phosphate)或(Ⅲ)即(Ⅰ)和(Ⅱ)的混合物等物质联合使用，这些物质具有促MDP衍生物的人工合成囊泡样颗粒形成的能力。在这种情况下，优先选用下列重量比值使用胆固醇MDP衍生物/胆固醇＝1/0～1/5，更优先选用的比值为1/0.5～1/2。使用卵磷脂MDP衍生物/卵磷脂＝1/0～1/50，更优先选用的比值为1/1～1/20。使用磷酸双鲸酯卵磷脂/磷酸双鲸酯＝1/0.05～1/2，更优先选用的比值为1/0.5～1/1。此外，与本专利技术的这个方面一致，并不一定必须使用表面活化剂及进行透析。从这点讲，本专利技术比经传统的形成NDP衍生物囊泡样颗粒的声波处理(超声波法)，微量注射，反相脱水等方面为优。本专利技术可使用的MDP衍生物包括许多种MDP的适当化学修饰物。这些MDP衍生物在日本公开专利(KOKAI)第52-46020，52-156812，54-73729，54-130517，55-19236，55-28932，55-28933，56-18996，56-49396和60-78997号中有论述。优先使用具有下列结构式的高级脂肪酯 其中Q代表合成的总共具有20～60个碳原子的高级脂肪酸残基;A代表L-丙氨酸，L-丝氨酸或甘氨酸，iso Gln代表异谷氨酰胺。更优先使用6-0-(2-四癸基六癸酰基)MDP，即B30-MDP。这些脂肪酯的论述发表在日本公开专利(Ko KAI)54-130517号上。具有下列结构式的MDP衍生物也可优先选用 其中X代表一种氨基酸，如L-丙氨酸，L-丝氨酸，L-缬氨酸及甘氨酸;Y代表-NH-A或 ，其中R1为氢原子，短链烷基，氨甲酰基或羧基;n为1～6;A为一个带或不带有侧链的具有8～30个碳原子的饱和或不饱和脂肪族烃链残基。这种衍生物更优先选用的例子包括Nα-(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰)-N-十八烷-L-赖氨酸，即MDP-LYS(L18)。更进一步，优先使用Nα-(N-乙酰胞壁酰-N-甲基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰)-Nε-十八烷-L-赖氨酸，即MDP(Me Ala)-Lys(18)。对此，日本公开专利60-78997对此有叙述。本专利技术使用的HANA抗原是自流感病毒感染的胚蛋中抽尿囊液，经高速离心或化学处理等纯化流感病毒步骤，用非离子型表面活化剂溶解此纯化病毒，如去利通X-100和NP-40;或用阳离子表面活化剂，如去氧胆酸钠和胆酸钠;或用阳离子表面活化剂，如十六烷三甲铵;也可借醚类有机溶剂溶解，然后通过蔗糖密度梯度离心，亲和层析等方法，进一步纯化所得的产物。以下非限定性实施例，将能更具体地说明本专利技术。实施例1流感HANA抗原的制备流感A/曼谷型/1/79(H3N2)病毒在鸡胚中生长，然后对生长出的病毒进行高速离心分离(23，000转/分钟，90分钟)，低速离心分离(6000转/分钟，60分钟)和蔗糖密度梯度离心(30，000转/分钟，3小时)。然后将去利通X-100加到病毒悬液至终浓度1%，充分搅拌此悬液，使病毒溶解后，再通过蔗糖密度离心，便可得到纯化的HANA抗原溶液。疫苗的制备与免疫试验利用上述得到的纯化HANA抗原溶液，按下述方法制备四种疫苗试样(它们的成分如表1所示)各个成分混合后，加入辛基苷至终浓度为3%(重量)。待这些成分溶解后，按传统方法放至磷酸盐缓冲液中进行透析，以此使每份样品的HANA抗原浓度调整至0.8微克当量/毫升，然后按每只小鼠0.5ml的剂量进行腹腔接种，总共接种十五只DDY小鼠(4周龄，雌鼠)接种后，将小鼠分成三个组，每组5只，分别于接种后一星期，二星期，三星期收集相应组的鼠血，按世界卫生组织的方法进行血凝抑制试验，以测定抗体形成能力。按上述同样方法，用前述各个样品对DDY小鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备流感疫苗的方法，该方法包括将流感ＨＡＮＡ疫苗与至少一种ＭＤＰ衍生物在适当的介质中混合，用可透析去除的表面活性剂使混合物溶解，溶解过程在胆固醇，卵磷脂和磷酸双鲸酯或它们的混合物存在或不存在的条件下进行；然后通过透析去除其中的表面活性剂，得到包括人工合成的流感ＨＡＮＡ抗原和ＭＤＰ衍生物复合体的囊泡样颗粒的流感疫苗。

【技术特征摘要】
JP 1985-6-6 123341/851.一种制备流感疫苗的方法，该方法包括将流感HANA疫苗与至少一种MDP衍生物在适当的介质中混合，用可透析去除的表面活性剂使混合物溶解，溶解过程在胆固醇，卵磷脂和磷酸双鲸酯或它们的混合物存在或不存在的条件下进行；然后通过透析去除其中的表面活性剂，得到包括人工合成的流感HANA抗原和MDP衍生物复合体的囊泡样颗粒的流感疫苗。2.根据权项1所述的方法，其中的溶解过程在胆固醇、卵磷脂及磷酸双鲸酯或它们的混合物存在的条件下进行。3.根据权项1所述的方法，其中的溶解过程于不存在胆固醇，卵磷脂及磷酸双鲸酯或它们的混合物的条件下进行。4.根据权项1所述的方法，其中流感HANA抗原与MDP衍生物的重量比为10/1～1/300。5.根据权项2所述的方法，其中MDP衍生物与胆固醇的重量比为1/0～1/5。6.根据权项2所述的方法，其中MDP衍生物与卵磷脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：根路铭国昭，大谷明，大隈邦夫，井上敦郎，
申请(专利权)人：国立予防卫生研究所，第一制药株式会社，化学及血清疗法研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]