本发明专利技术公开了一种人成骨肉瘤干细胞相关抗原标记物ＳＳＥＡ－４及其在成骨肉瘤靶向治疗中的应用。ＳＳＥＡ－４是一特异性的成骨肉瘤干细胞表面标记物，在各正常成体组织中几乎不表达。此表面标记物易于抗体标记，不影响细胞活力，适合分离后的功能实验，为进一步研究干细胞在成骨肉瘤的起源、发生和发展过程的作用提供了一可靠的分子示踪物，为解释临床成骨肉瘤耐药、转移和寻找靶向治疗的细胞和分子靶点奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肿瘤生物学领域，更具体地讲，涉及一种人成骨肉瘤干细胞相关抗原 标记物及其应用。
技术介绍
近年来，随着对肿瘤干细胞理论认识的不断深入，要求我们对肿瘤的起源和发生、 发展有更加清楚的认识。尤其是对白血病、乳腺癌、人神经胶质瘤和大肠癌等肿瘤干细胞 分离和鉴定工作的报道，不仅印证和巩固了肿瘤干细胞理论，也使对其他肿瘤干细胞的鉴 定和内在分子机制特征的研究成为热点。目前，国内外关于成骨肉瘤干细胞的报道极少， 2005年国外Gibbs等人采用体外培养方式，首次从细胞系中分离出含有干细胞样骨肉瘤细 胞的肉瘤细胞球(sarcosphere)，表达多种间充质干细胞的表面标记物(如Stro-1、CD44 和0)10 以及胚胎干细胞特征基因(Nanog和Oct-4) ；2007年Colleen胁等发现体外培 养之成骨肉瘤细胞群体中存在SP细胞，但也未能分离鉴定具体的、特异性的成骨肉瘤干细 胞表面标记物。最为重要的是，这些工作均不是基于人原代肿瘤组织的研究工作，未进行严 格的细胞分离和体内接种试验。2005年Gibbs等人首次分离出含有干细胞样骨肉瘤细胞的肉瘤细胞球以及2007 年Colleen 等人从肉瘤病人标本中发现SP细胞。一方面，上述学者的工作主要局限 于体外细胞培养水平，未能在体内建立成骨肉瘤细胞异种移植模型以鉴定成骨肉瘤干细 胞的表型和功能(而这是肿瘤干细胞研究的金标准)；另一方面，SP细胞的分离方法存在 h0echst33342染料毒性、细胞活力低下、仪器配置较高等局限性。因而分离和鉴定特异性的 成骨肉瘤干细胞表面标记物是进行肿瘤干细胞针对性研究的技术基础。SSEA-4 的现有研究和应用SSEA-4 即 stage specific embryonic antigen4，是属 于阶段特异性胚胎抗原的一种，作为一种早期胚胎的糖脂类抗原，常用作为胚胎干细胞和 间充质干细胞的表面标志物，但从未肿瘤干细胞的鉴定和筛选，本专利技术第一次将SSEA-4作 为表面标志物，作为成骨肉瘤干细胞的鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人成骨肉瘤干细胞相关抗原标记物。本专利技术的第二个目的是提供所述人成骨肉瘤干细胞相关抗原标记物SSEA-4在成 骨肉瘤靶向治疗中的应用。本专利技术利用前期建立的19个人成骨肉瘤跨物种移植模型和无血清培养技术，从 体内和体外两方面，分离和鉴定出具有间充质干细胞和胚胎干细胞双重特征的成骨肉瘤表 面标记物SSEA-4与肿瘤干细胞群体共存。表面标记物SSEA-4易于抗体标记，标记不影响 细胞活力，适合分离后的功能实验；同时SSEA-4不仅提示成骨肉瘤可能起源于间充质干细 胞阶段，为后续机制研究提供具体分子对象和模型平台。在临床上，在一部分病人中的表达 程度，能够提示其恶性程度、转移及预后情况，是潜在的可作为靶向治疗的分子靶点。由于成骨肉瘤病人原代标本跨物种移植成功率较低，所以我们尝试了大量的临床 标本，最后得到3个动物模型。另外，我们检测了多个具有间充质干细胞和胚胎干细胞表面 标记物，根据表达情况和文章报道的相关标记物，选择具有间充质干细胞和胚胎干细胞双 重特征的SSEA-4作为骨肉瘤表面标记物后，遂加以证实，最后我们结合细胞系和病人临床 标本，对标记物的特异性进行了验证。SSEA-4是一特异性的成骨肉瘤干细胞表面标记物，在各正常成体组织中几乎不表 达。此表面标记物易于抗体标记，不影响细胞活力，适合分离后的功能实验，为进一步研究 干细胞在成骨肉瘤的起源、发生和发展过程的作用提供了一可靠的分子示踪物，为解释临 床成骨肉瘤耐药、转移和寻找靶向治疗的细胞和分子靶点奠定了基础。附图说明下面结合说明书附图，对本专利技术进一步详细说明。图1 成骨肉瘤细胞免疫表型的筛选。选择间充质干细胞和胚胎干细胞常用的表 面标记物 CD105、CD166、CD117、CD90、CD44、STR0-1、SSEA-4、SSEA-3 等。图2A 原代成骨肉瘤细胞表达SSEA-4和0ct_4 ；图2B 建立的成骨肉瘤细胞系 5well 表达 SSEA-4 和 0ct_4。图3 成骨肉瘤病理标本免疫组化显示SSEA-4、nanog、oct_4表达。图4 成骨肉瘤原代细胞在体外无血清培养条件下形成sphere。具体实施例方式I、我们在前期研究中，采用初发成骨肉瘤病人的原代标本，消化成单细胞悬液后， 利用无血清培养技术和N0D/SCID小鼠成功建立了成骨肉瘤细胞球和跨物种移植模型。通 过流式细胞分析技术，对取自成瘤小鼠的成骨肉瘤细胞进行表型分析，发现这些细胞经常 表达SSEA-3、SSEA-4、CD184、CD105、CD166和CD49d等多个具有间充质干细胞和胚胎干细 胞表面标记物。II、对SSEA-4进行更加详尽的验证利用细胞系，采用免疫荧光和免疫组化得方 法，进行表型鉴定和验证，在原代标本中测试表达情况等。III、通过对不同表面标记物之间更加细致的区分和比较，选取一小部分特异性最 强的标记物，进行免疫荧光抗体标记，利用流式分选技术将不同表达情况的成骨肉瘤细胞 分选出来，分别以梯度稀释的方式移植入N0D/SCID小鼠，通过对成瘤情况的比较分析，选 定与成骨肉瘤致瘤能力最为相关的特异的表面标记物，即SSEA-4。IV、将得到的成骨肉瘤原代细胞在体外无血清培养条件下，加入FGF、N2B27等细 胞因子，能在体外形成成骨肉瘤细胞球(sphere)。权利要求1.一种人成骨肉瘤干细胞相关抗原标记物，其特征在于，所述标记物是SSEA-4。2.权利要求1所述的人成骨肉瘤干细胞相关抗原标记物在成骨肉瘤靶向治疗中的应用。全文摘要本专利技术公开了一种人成骨肉瘤干细胞相关抗原标记物SSEA-4及其在成骨肉瘤靶向治疗中的应用。SSEA-4是一特异性的成骨肉瘤干细胞表面标记物，在各正常成体组织中几乎不表达。此表面标记物易于抗体标记，不影响细胞活力，适合分离后的功能实验，为进一步研究干细胞在成骨肉瘤的起源、发生和发展过程的作用提供了一可靠的分子示踪物，为解释临床成骨肉瘤耐药、转移和寻找靶向治疗的细胞和分子靶点奠定了基础。文档编号G01N33/533GK102053150SQ200910197959公开日2011年5月11日 申请日期2009年10月30日 优先权日2009年10月30日专利技术者张伟宾, 张武, 诸江 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人成骨肉瘤干细胞相关抗原标记物，其特征在于，所述标记物是ＳＳＥＡ－４。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张武，诸江，张伟宾，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：31
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